摘要：為探討分離自患病刺參(Apostichopus japonicus)的一株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染刺參后，刺參體腔細胞免疫相關基因的響應變化，分別給刺參注射100 μL生理鹽水(對照組)和1×109 CFU/mL溶藻弧菌菌液(實驗組)，用熒光定量PCR技術，檢測24 h內(nèi)刺參體腔細胞Lys、Rel和p105基因表達的變化。結果表明，注射生理鹽水對刺參體腔細胞Lys、Rel和p105基因表達量無顯著影響。感染溶藻弧菌后，實驗組刺參體腔細胞中溶菌酶基因的表達量在24 h顯著升高，且1 h和24 h時的表達量顯著高于對照組(P<0.05);刺參體腔細胞中p105基因在感染后表達量呈上升趨勢，3 h達到峰值，在3 h和6 h，p105基因的表達量顯著高于對照組(P<0.05);刺參體腔細胞Rel基因表達量在感染后無顯著變化。可見刺參感染溶藻弧菌后其體腔細胞Lys和p105基因的表達在短時間內(nèi)迅速響應。

　　關鍵詞：刺參(Apostichopus japonicus);溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus);體腔細胞;基因表達

　　溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬于弧菌科，弧菌屬，革蘭氏陰性菌，是一種常見的海洋致病菌，對魚、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動物都有較強的致病性[1-4]。溶藻弧菌會在侵襲和增殖過程中對機體造成細胞和組織損傷以及其代謝產(chǎn)物干擾和破壞機體的局部或全身的正常新陳代謝或機能[3-5]。盧芷程等[5]的研究結果表明溶藻弧菌感染凡納濱對蝦后會啟動其免疫機制并產(chǎn)生活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)以對抗病原菌入侵，隨感染時間的延長抗氧化系統(tǒng)會被激活。李晶晶等[6]在研究中也表明凡納濱對蝦感染溶藻弧菌后，需要不斷保持較高的免疫水平，其體內(nèi)的3種Toll樣受體(Toll-like receptors)基因在血淋巴與鰓中的表達量均顯著升高。溶藻弧菌也是刺參病害的主要致病菌之一[7]，但關于其對刺參免疫的研究較少。刺參體腔細胞在刺參非特異性免疫中起著非常重要的作用，是其最基本的防御武器[8]。溶菌酶是刺參體腔細胞重要的免疫抗菌蛋白，其活性是表征機體對細菌性病原抵抗能力的重要指標[9]。核因子κB(NF-κB)信號通路是先天性免疫中最為重要的途徑，Rel、p105是該信號通路上重要的轉錄因子，同時Rel、p105基因已在刺參上被成功克隆到序列[10]。因此本研究聚焦刺參體腔細胞的非特異性免疫，選取刺參體腔細胞溶菌酶(Lys)、Rel、p105基因為目標基因，探討刺參體腔細胞對溶藻弧菌(從患病刺參體壁分離)刺激后24 h內(nèi)Lys、Rel、p105免疫基因的響應，為進一步探究刺參抵抗溶藻弧菌感染的免疫機理提供基礎參考。

　　1材料與方法

　　1.1實驗動物

　　實驗所用刺參購買于東方海洋生物科技有限公司。選取平均體重為3 g的健康刺參200頭，暫養(yǎng)于連續(xù)充氣的水箱中，常規(guī)養(yǎng)殖管理，暫養(yǎng)1周。實驗開始前將刺參分為實驗組與對照組。

　　1.2實驗菌株

　　實驗菌株分離自患病刺參，經(jīng)16S rDNA鑒定為溶藻弧菌。使用2216E培養(yǎng)基，28 ℃對其進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)過夜后，離心(6 000 r/min，10 min，4 ℃)收集菌體，菌體用0.85%的生理鹽水重懸，將細菌濃度調(diào)節(jié)至1×109 CFU/mL備用。

　　1.3溶藻弧菌的急性感染與樣品采集

　　注射實驗開始前，取18頭刺參，每6頭刺參的體腔細胞混在一起，作為一個重復，即為0時刻的樣本。對照組每頭刺參體壁注射0.1 mL生理鹽水，多點注射。實驗組每頭刺參體壁注射0.1 mL濃度為1×109 CFU/mL的溶藻弧菌菌液，多點注射。注射后分別在1、3、6、12、24 h取樣，每個時刻隨機取18頭刺參，解剖刺參獲取刺參的體腔液，每6頭刺參的體腔液混合在一起作為一個重復樣本，每一時刻三個重復。體腔液轉入離心管中，4 000 r/min，4 ℃離心，去上清，每管體腔細胞加入1 mL TransZolTM Up(北京全式金)，并用槍反復吹吸，使體腔細胞裂解，液氮速凍，轉入-80 ℃冰箱保存，用于體腔細胞RNA的提取。

　　1.4免疫相關基因表達量的測定

　　1.4.1刺參體腔細胞RNA的提取取-80 ℃保存的刺參體腔細胞，按照TransZolTM Up Plus RNA Kit (北京全式金)試劑盒說明提取RNA。用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否被降解;用微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度。RNA-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4.2cDNA的合成和熒光定量PCR使用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix (北京全式金)試劑盒對刺參體腔細胞RNA進行反轉錄。向無RNAase的PCR管中依次加入500 ng模板RNA、4 μL 5×TransScript All-in-One SuperMix for qPCR、1 μL gDNA Remover，補足RNase-free Water 至20 μL。輕輕混勻，42 ℃孵育15 min。85 ℃加熱5 s。得到的cDNA -20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

　　引物設計參考Wang等[10]、Yang 等[11]，由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。按照TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix (北京全式金)試劑盒操作說明，進行熒光定量PCR。擴增反應體系如下：Template 1 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 04 μL、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、dd H2O 8.2 μL。PCR 程序為： 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 10 s;56 ℃ 25 s;72 ℃ 25 s，共40個循環(huán)。以Cytb為內(nèi)參基因，基因的相對表達量以 2-ΔΔ CT法進行計算[12]。

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