摘要：為明確蒙古黃芪苗期立枯病害及其病原菌種類，采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離，并根據(jù)其培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)rDNA-ITS特征進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，該病害的病原菌為立枯絲核菌(Rhizotonia solani)。室內(nèi)致病性測試結(jié)果表明，立枯絲核菌可引起蒙古黃芪苗期立枯病。本研究首次報(bào)道了蒙古黃芪苗期立枯病及其病原菌，可為生產(chǎn)上該病害的防治提供理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞：苗期;蒙古黃芪;立枯病;病原鑒定;致病性測定

　　引言

　　黃芪(Astragalus menbranaceus)是豆科黃芪屬多年生草本植物，有蒙古黃芪(Astragalus menbranaceus var. mongholicus)和膜莢黃芪(Astragalus menbranaceus)[1]，以干燥的根入藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效[2]。蒙古黃芪原產(chǎn)于山西、內(nèi)蒙、河北、陜西和甘肅等地。甘肅省隴西縣是國內(nèi)主要的道地黃芪產(chǎn)區(qū)之一，具有品質(zhì)優(yōu)和產(chǎn)量高等特點(diǎn)，被中國特產(chǎn)組委會(huì)命名為“中國黃芪之鄉(xiāng)”。隨著甘肅省黃芪人工栽培面積的逐年擴(kuò)大、黃芪連作生長環(huán)境的改變和土壤病原菌數(shù)量的不斷積累，黃芪病害已成為制約其產(chǎn)量增加和品質(zhì)提升的重要因素之一。

　　關(guān)于黃芪的一些病害國內(nèi)學(xué)者有研究。陳宏宇等[3]對黃芪根腐病的發(fā)病因素進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫濕度、土壤質(zhì)地、茬口對黃芪根腐病的發(fā)生都有一定的影響，連作是黃芪根腐病發(fā)生的主要因素之一，輪作對根腐病的防治作用明顯。據(jù)報(bào)道[4-9]黃芪根腐病的主要病原菌為尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporium)、茄病鐮孢菌(Fusariumsonali)、銳頂鐮刀菌(Fusarium acuminatum)、芬芳鐮刀菌(Fusarium redolens)、鏈格孢菌(Alternaria sp.)和Ilyonectria torresensis等。駱得功等[10]、陳泰祥等[11]和陳秀蓉等[12]對甘肅省隴西縣幾個(gè)重病區(qū)的黃芪霜霉病病原菌鑒定為黃芪霜霉菌(Peronospora astragalina)。任舉[13]報(bào)道，黃芪葉部的銹病由單孢銹菌屬(Uromyces)真菌引起。李綏峰[14]、孫樹文等[15]、徐福祥[16]、邢占民[17]、周天旺等[18]和陳泰祥等[19]對黃芪白粉病的發(fā)生特點(diǎn)、發(fā)生規(guī)律、病原種類及防治進(jìn)行了研究。馬瑩瑩等[20]系統(tǒng)總結(jié)了黃芪主要病害的發(fā)生情況、致病菌種類的多樣性、抗病品種選育、栽培管理模式、土壤營養(yǎng)、化學(xué)防治和生物防治等，為黃芪病害的綜合防治提供了參考。關(guān)于立枯絲核菌引起的黃芪根病有報(bào)道，但由其引起的苗期黃芪立枯病未見報(bào)道。因此，筆者對定西市苗期發(fā)生的黃芪立枯病的發(fā)病癥狀進(jìn)行研究，以確定其病原種類和致病性，為苗期黃芪立枯病的田間防治提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1病樣采集及田間病害分級

　　在定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院黃芪種植基地，采集苗期黃芪立枯病發(fā)病植株，記錄采集信息后裝入自封袋。采用5點(diǎn)取樣法進(jìn)行田間調(diào)查，每點(diǎn)30株。病害分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級—根部無病斑，1級—根部病斑面積占總根部面積的1/4以下，3級—根部病斑面積占總根部面積的1/4～1/2，5級—根部病斑面積占總根部面積的1/2～3/4，7級—根部病斑面積占總根部面積的3/4以上。

　　1.2病原菌分離

　　采用常規(guī)組織分離法[21]，無菌條件下剪取病健交界處組織塊5 mm×5 mm置于75%酒精中浸泡5 s，然后轉(zhuǎn)移至1.5%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，無菌水漂洗3次晾干，置于PDA培養(yǎng)基平板內(nèi)于25℃培養(yǎng)5～7天。將分離純化的菌株轉(zhuǎn)接至PDA斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.3病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

　　將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)7天后，觀察并拍照記錄菌落形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子大小。根據(jù)魏景超[22]的分類方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病原菌種類鑒定。

　　1.4病原菌分子生物學(xué)鑒定

　　1.4.1真菌基因組DNA提取刮取PDA培養(yǎng)基上的病原菌菌絲，按照真菌基因組DNA快速抽提試劑盒E.Z. N.A HP Fungal DNA Kit(OMEGA)的步驟提取DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4.2分子鑒定的引物試驗(yàn)采用真菌核糖體基因ITS區(qū)域引物D1和D2，引物序列分別為ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4-R(TCCTCCG CTTATTGATATGC)。

　　1.4.3 PCR擴(kuò)增、凝膠電泳、測序及序列分析PCR擴(kuò)增體系(20μL)：2×Taq PCR SuperMix 10μL，10μmol/L正反向引物各1μL，DNA模板1μL，用ddH2O補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min;94℃變性20 s，50℃退火10 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸2 min，4℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

　　1.4.4 rDNA序列比較分析與系統(tǒng)發(fā)育樹使用BioEdit校對測序結(jié)果并拼接序列。測序后的序列經(jīng)校正后，在核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank中進(jìn)行同源序列搜索，比較測試菌株與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列的相似程度，獲得同源性較高的立枯絲核菌ITS序列，應(yīng)用DNAMAN進(jìn)行序列比對分析，并用Mega 6.0 Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

　　1.5病原菌致病性測定

　　采用柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定，將滅菌土裝入高和直徑都為15 cm的花盆中，挑選大小一致且無病斑的黃芪苗3株移栽，共移栽6盆。待黃芪莖稈長至6 cm時(shí)撥開花盆上部8 cm土壤，將分離純化的病原物打成10 mm菌餅，分別做針刺和無刺傷接菌，以未接菌PDA培養(yǎng)基為對照，每株接1個(gè)菌餅，回填土壤澆水。50天后調(diào)查發(fā)病情況，同時(shí)將發(fā)病部位再次分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定確定分離得到的病原菌與初接病原菌是否為同一病原菌。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1發(fā)病癥狀

　　田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，苗期黃芪立枯病在6月上旬發(fā)病，8月進(jìn)入發(fā)病盛期。地上部發(fā)病植株長勢衰弱，葉色灰綠，失水狀，少數(shù)葉片枯萎，提前脫落(圖1a)。根莖部產(chǎn)生不規(guī)則形黑褐色網(wǎng)狀病斑，圍繞整個(gè)根莖，病斑不凹陷(圖1b)。

　　2.2形態(tài)學(xué)鑒定特征

　　在PDA培養(yǎng)基上(圖2a～b)，菌落初為白色，逐漸變?yōu)榈稚辽詈稚?，菌落中間較密，邊緣稀疏。3～4天形成“菌核”，菌核初為白色，后變紫褐色至深褐色。初生菌絲無色，粗細(xì)較均勻，直徑4.98～8.79μm，分枝呈直角或近直角，分枝處大多有縊縮(圖2c)，附近生有一隔膜。

　　2.3核糖體rDNA-ITS序列分析

　　測序結(jié)果與GenBenk數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Nucleotide Blast比對，與立枯絲核菌的ITS片段同源性達(dá)100%。用Mega 7.0軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，黃芪立枯病與Rhizoctonia solani親緣關(guān)系最近(圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，將引起黃芪立枯病的病原菌鑒定為立枯絲核菌(R. solani)。

　　2.4致病性測定

　　室內(nèi)致病性測試結(jié)果(圖4)表明，接菌植株表現(xiàn)出與自然病株相同的癥狀，未接菌植株表現(xiàn)正常，從接種發(fā)病黃芪植株上全部分離到病原菌，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為立枯絲核菌。

　　3討論

　　植物病害病原種類的確定是防治的前提和基礎(chǔ)，明確病原種類對制定合理的防治策略和提高防治效果有重要的指導(dǎo)作用。本試驗(yàn)首次報(bào)道了苗期黃芪立枯病的發(fā)病癥狀，同時(shí)明確了該病害的病原菌為立枯絲核菌。