摘要：為探討青楊天牛嗅覺(jué)基因的種類(lèi)，以期為采用RNA干涉技術(shù)調(diào)控青楊天牛種群提供理論依據(jù)，采用Illumina HiSeqTM 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)青楊天牛的觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用BLAST同源搜索的方法鑒定嗅覺(jué)相關(guān)的基因，采用RT-PCR技術(shù)研究嗅覺(jué)相關(guān)基因的表達(dá)譜。共鑒定出青楊天牛嗅覺(jué)基因包括：43個(gè)氣味結(jié)合蛋白(OBP)、15個(gè)化學(xué)感受蛋白(CSP)、56個(gè)嗅覺(jué)受體(OR)和24個(gè)離子受體(IR)。反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)結(jié)果表明，青楊天牛的嗅覺(jué)基因存在性別及組織器官間的特異性。

　　關(guān)鍵詞：青楊天牛;嗅覺(jué)基因;表達(dá)分析

　　昆蟲(chóng)在與植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，形成高度特化并且靈敏的嗅覺(jué)感受系統(tǒng)以識(shí)別外界環(huán)境中的各種化學(xué)信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)化為體內(nèi)的電信號(hào)，最終指導(dǎo)昆蟲(chóng)完成寄主選擇、求偶、交配、產(chǎn)卵、躲避天敵等一系列的行為[1-2]。參與昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別的蛋白質(zhì)，主要包括：氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)、氣味受體(odorant receptors，ORs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)、感覺(jué)神經(jīng)膜蛋白(sensory neuron membrane proteins，SNMPs)、離子型受體(ionotropic receptors，IRs)、氣味降解酶(odorant-degrading enzymes，ODEs)等[3-4]。

　　青楊天牛(Saperda populnea)隸屬鞘翅目(Coleoptera)、天牛科(Cerambycidae)、溝脛天牛亞科(Lamiinae)、楔天牛屬(Saperda)，又名青楊楔天牛[5]，廣泛分布于我國(guó)的北方地區(qū)，是我國(guó)重要的森林防治檢疫對(duì)象，主要危害楊屬(Populus)和柳屬(Salix)的林木[6]。青楊天牛的幼蟲(chóng)主要鉆蛀幼齡楊樹(shù)的枝干，受害部位形成紡錘狀的蟲(chóng)癭，阻礙楊樹(shù)養(yǎng)分的正常運(yùn)輸，造成枝梢干枯，易遭風(fēng)折，如危害在幼樹(shù)主干髓部，可造成整株枯萎死亡[7]。由于天牛體表具有較為堅(jiān)硬的鞘翅，傳統(tǒng)的化學(xué)防治及生物防治手段很難達(dá)到理想的防治效果。目前，基于天牛成蟲(chóng)與寄主植物之間化學(xué)信息聯(lián)系的化學(xué)生態(tài)研究，已成為天牛防治新途徑的研究熱點(diǎn)。諸多研究表明，天牛的嗅覺(jué)在利用寄主植物釋放的揮發(fā)性次生物質(zhì)識(shí)別寄主的過(guò)程中起非常關(guān)鍵的作用。本研究旨在通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-PCR技術(shù)確定青楊天牛主要的嗅覺(jué)相關(guān)蛋白基因及其表達(dá)譜情況，為基于嗅覺(jué)調(diào)控的環(huán)境友好型害蟲(chóng)防治新技術(shù)的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　在吉林省白城市鎮(zhèn)賚縣采集到被青楊天牛危害的青楊樹(shù)枝，帶回室內(nèi)并在養(yǎng)蟲(chóng)籠中培養(yǎng)[溫度：(27±1) ℃，濕度：(75±5)%，光—暗周期16 h—8 h]直到成蟲(chóng)羽化，并飼喂楊樹(shù)側(cè)枝和葉子。

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　1.2.1 RNA提取和cDNA合成

　　在體式顯微鏡下，使用DEPC處理過(guò)的鑷子將羽化10 d左右的青楊天牛成蟲(chóng)觸角剝離，共選取20頭成蟲(chóng)，分別包括10頭雌蟲(chóng)和10頭雄蟲(chóng)。獲取的組織在使用前需在經(jīng)DEPC處理過(guò)的1 ∶1的水和乙醇溶液中在冰上保存。總RNA的提取使用TRIzol溶液將觸角混勻，提取后，在乙醇/異丙醇沉淀中加入30 μL去RNA酶水。在提取結(jié)束后，整個(gè)RNA用Nano-Drop 2000(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在紫外吸收值 230 nm/260 nm和260 nm/280 nm下檢測(cè)RNA產(chǎn)物的純度，在28S rRNA條帶證實(shí)了RNA的完整性。在RT-PCR試驗(yàn)中從5頭天牛個(gè)體中獲得RNA樣品。從雌性樣品中得到共2 000 ng的總RNA。因此，相同數(shù)量的總RNA被轉(zhuǎn)化成cDNA，通過(guò)20 μL體系，包括：4 μL的first-strand buffer(250 mmol/L Tris pH值8.3、375 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2)，1 μL 10 mmol/L dNTP mix、1 μL RNaseout、1 μL DTT(0.1 mol/L)、1 μL oligo-(dT) 20 primer(50 μmol/L)和1 μL Superscript Ⅲ reverse transcriptase(200 units/μL)(Invitrogen，15 Carlsbad，CA，USA)。cDNA的合成在50 ℃下進(jìn)行45 min后在70 ℃下進(jìn)行15 min。

　　1.2.2 RNA測(cè)序、組裝和功能注釋

　　對(duì)于RNA測(cè)序，總RNA樣品用Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)和Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)進(jìn)行測(cè)序。高質(zhì)量的RNA被送到博瑞得科技公司(中國(guó)楊凌)用于cDNA的建庫(kù)和測(cè)序。mRNA的純化使用magnetic oligo(dT)beads(中國(guó)北京全式金)。RNA序列庫(kù)用AMPure XP bead kit的隨機(jī)接頭引物來(lái)進(jìn)行Illumina 測(cè)序(Beckman Coulter，Inc.，Brea，CA，USA)。觸角cDNA樣品使用AMPure XP beads(Beckman Coulter，Inc.)進(jìn)行純化。短cDNA片段通過(guò)末端修復(fù)配適器進(jìn)行擴(kuò)增。合適長(zhǎng)度的片段利用Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter，Inc.)選擇并通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)序通過(guò)Illumina HiSeqTM 2500進(jìn)行。

　　1.2.3 青楊天牛嗅覺(jué)相關(guān)基因的鑒定

　　根據(jù)本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，與已鑒定出的包括云斑天牛[8]、松褐天牛[9-10]和光肩星天牛[11]的嗅覺(jué)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，對(duì)青楊天牛嗅覺(jué)基因進(jìn)行命名。

　　1.2.4 青楊天牛嗅覺(jué)相關(guān)基因RT-PCR

　　收集不同組織時(shí)選取觸角20對(duì)、頭部(去除觸角)10個(gè)、胸部10個(gè)、腹部10個(gè)、足和翅各30對(duì)。選擇青楊天牛觸角具有全長(zhǎng)閱讀框的同源基因，其中包括：22個(gè)OBP、9個(gè)CSP、9個(gè)OR、4個(gè)觸角IR(IR8a1、IR8a2、IR25a和IR76b)及它們的亞型進(jìn)行RT-PCR分析。進(jìn)行半定量RT-PCR的cDNA樣品制備同上。為進(jìn)行表達(dá)定量和半定量RT-PCR試驗(yàn)，從雌性天牛觸角和其他器官提取的1 μL DNA酶處理后的cDNA樣品作為模板，以β-Actin作為內(nèi)參基因。

　　PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性1 min 30 s;94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，32個(gè)循環(huán);最后68 ℃ 7 min。12 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物至少進(jìn)行3次重復(fù)，采用ImageJ 1.6進(jìn)行分析。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 青楊天牛觸角轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)分析

　　2.1.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

　　由圖1可知，測(cè)序產(chǎn)生的clean堿基數(shù)為15.35 Gb。最終篩選得到 87 984 條unigene。所有87 984條unigene平均長(zhǎng)度為471.41 bp，其中長(zhǎng)度(1～2 kb)有5 612 unigene，長(zhǎng)度(>2 kb)有2 492 unigenes，長(zhǎng)度超過(guò) 1 kb 有8 104 unigene，其中36 147 unigene與已知蛋白基因匹配。

　　2.1.2 基因功能注釋

　　由圖2可知，GO分類(lèi)結(jié)果，12 932個(gè)成功進(jìn)行GO注釋的unigene可以分成3個(gè)類(lèi)別：累積到生物學(xué)過(guò)程(biological process)不同亞類(lèi)的26 942個(gè)次，細(xì)胞組分(cellular component)不同亞類(lèi)的17 735個(gè)次，歸到分子功能(molecular function)不同亞類(lèi)的15 944個(gè)次。在生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別中，metabolic process和cellular process基因數(shù)最高，分別為8 343個(gè)和6 174個(gè);細(xì)胞組分類(lèi)別中，cell part和cell是最高的2個(gè)亞類(lèi)，分別是3 963個(gè)和 3 961個(gè);而與觸角基因表達(dá)相關(guān)的catalytic activity和binding是分子功能類(lèi)別中豐度最高的2個(gè)亞類(lèi)，分別為7 203個(gè)和6 270個(gè)。

　　由圖3可知，青楊天牛觸角unigene按照同源基因數(shù)據(jù)聚類(lèi)(COG，clusters of orthologous groups databases)功能注釋?zhuān)煞譃?25 個(gè)功能群。其中，注釋為一般功能預(yù)測(cè)類(lèi)，復(fù)制、重組及修復(fù)類(lèi)，翻譯與核糖體構(gòu)建及合成生物源類(lèi)的unigene個(gè)數(shù)最多，分別為3 051、1 349、1 279條;而注釋為核酸結(jié)構(gòu)類(lèi)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)類(lèi)、RNA加工和修飾類(lèi)的unigene最少，分別為4、19、80條。

　　2.2 青楊天牛嗅覺(jué)相關(guān)基因的鑒定

　　由表1、表2可知，共鑒定出青楊天牛嗅覺(jué)基因包括：43個(gè)OBP、15個(gè)CSP、56個(gè)OR和24個(gè)IR。根據(jù)它們的長(zhǎng)度、啟動(dòng)子密碼子、終止密碼子和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，22個(gè)OBP、9個(gè)CSP、4個(gè)OR和2個(gè)IR具有全長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框。

　　2.3 青楊天牛嗅覺(jué)相關(guān)基因的表達(dá)

　　由圖4可知，RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然SpopOBP3、SpopOBP4、SpopOBP6、SpopOBP9、SpopOBP10、SpopOBP23、SpopOBP27、SpopOBP29、SpopOBP33和SpopOBP38在非嗅覺(jué)組織中表達(dá)，大量的嗅覺(jué)基因仍在觸角特異性的表達(dá)。其中，SpopIR76b、SpopOR24、SpopOBP3、SpopOBP4、SpopOBP6、SpopOBP16、SpopOBP17、SpopOBP19、SpopOBP23、SpopOBP24、SpopOBP33、SpopCSP3、SpopCSP4、SpopCSP5和SpopCSP7 在青楊天牛的觸角中高表達(dá)。

　　3 討論與結(jié)論

　　本研究共鑒定出青楊天牛嗅覺(jué)基因主要包括：43個(gè)氣味結(jié)合蛋白(OBP)、15個(gè)化學(xué)感受蛋白(CSP)、56個(gè)嗅覺(jué)受體(OR)和24個(gè)離子受體(IR)。這些基因存在性別特異性，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步深入研究。

　　與光肩星天牛的OR相比較[11]，由表2可知，青楊天牛的OR數(shù)量相對(duì)較低，說(shuō)明大量青楊天牛的OR可能沒(méi)有被鑒定出來(lái)。然而，青楊天牛的OR數(shù)量明顯高于松褐天牛，說(shuō)明本研究中的測(cè)序深度是足夠的。此外，本研究鑒定出43種青楊天牛的OBP，在光肩星天牛和松褐天牛分別鑒定出51種和52種[10-11]，為以后進(jìn)一步的嗅覺(jué)相關(guān)基因進(jìn)化分析提供了充足的數(shù)據(jù)。

　　大量的CSP在非嗅覺(jué)組織中，表明CSP的功能是探測(cè)二氧化碳、幼蟲(chóng)的發(fā)育和足的再生[12]。SpopOBP24在雌性觸角中高表達(dá)，說(shuō)明該基因與雌蟲(chóng)的特異性行為有關(guān)，例如交配和產(chǎn)卵。Zhang等研究表明，在一些種類(lèi)的天牛中存在接觸性性信息素(contact sex pheromone)[13]，因此SpopOBP24值得進(jìn)一步深入研究。SpopOBP23、SpopCSP3和SpopCSP4在雄性觸角中高表達(dá)。Leal等發(fā)現(xiàn)一些種類(lèi)的天牛存在雄性信息素，但青楊天牛的性信息素成分目前并不明確，有必要進(jìn)一步對(duì)SpopOBP23、SpopCSP3和SpopCSP4的功能進(jìn)行研究[14]。