摘 要：多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)屬于芽孢桿菌屬，是一類產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，可以產(chǎn)生多肽類、蛋白類、酶類、功能性多糖及其他代謝活性物質(zhì)。現(xiàn)代研究表明，多糖類化合物具有廣泛的生理功能。隨著研究的不斷深入，多粘類芽孢桿菌胞外多糖已被證明具有抗氧化性、免疫活性、抗腫瘤性等功能，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域及生態(tài)農(nóng)業(yè)方面有著廣泛的發(fā)展前景。該文綜述了多粘類芽孢桿菌菌株來源及其胞外多糖的發(fā)酵工藝、提取、分離純化、結(jié)構(gòu)分析及功能方面的研究進(jìn)展，并對其未來的發(fā)展研究進(jìn)行了展望。

　　關(guān)鍵詞：多粘類芽孢桿菌;胞外多糖;發(fā)酵工藝;提取;結(jié)構(gòu)分析;生物活性

　　多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)是類芽孢桿菌的模式菌[1]。類芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性好氧或兼性厭氧菌，能產(chǎn)生芽孢，抗逆性極強，在高酸、高堿、高寒、高鹽的逆境下生長良好[2]。其細(xì)胞呈直桿狀，菌落特征多成淺黃色或白色的黏稠狀，表面濕潤光滑;靠周生的鞭毛運動，膨大孢子囊中產(chǎn)生橢圓形芽孢;最適生長溫度為28～35℃，最適pH7.0，能產(chǎn)酸，有時產(chǎn)氣[3]。多粘類芽孢桿菌廣泛存在于自然界中，多數(shù)在植物體內(nèi)外及根際土壤中分離而來，作為一類重要的根際有益菌[4]，其具有促進(jìn)植物生長和生物防治的作用，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。多粘類芽孢桿菌具有良好的生物學(xué)活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)類、多糖、多肽類、脂類[5]。近年來的研究表明，多粘類芽孢桿菌胞外多糖具有凈化水質(zhì)[6]，吸收廢水中的重金屬離子[7]等作用，在環(huán)境生態(tài)領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價值。此外，它還具有抗氧化性、抗腫瘤性、調(diào)節(jié)免疫等生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域中有著重要作用。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖在農(nóng)藥助劑方面也發(fā)揮著重要作用，包括助懸浮和熱保護(hù)作用[8]。多粘類芽孢桿菌有多種生物學(xué)活性，對人畜安全和無污染，具有廣泛的應(yīng)用前景而受到青睞，美國環(huán)保署(EPA)將其列為可在商業(yè)上應(yīng)用的微生物[9]。

　　胞外多糖作為一種生物材料的來源，近年來受到了越來越多的關(guān)注。微生物多糖具有生產(chǎn)過程可控性高、不受外界因素影響、生產(chǎn)周期短，具有獨特的理化性質(zhì)及生物活性等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。微生物多糖由范圍極廣的單糖構(gòu)成，具有十分復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其活性受發(fā)酵條件、提取工藝、純度、含量等多因素的綜合影響。因此，菌株發(fā)酵的條件及胞外多糖的提取、分離純化對后續(xù)結(jié)構(gòu)分析鑒定及其活性功能的研究尤為重要。在多粘類芽孢桿菌發(fā)酵過程中，會產(chǎn)生大量的胞外多糖，容易分離提取。本文綜述了多粘類芽孢桿菌的來源及其多糖的提取工藝、純化、結(jié)構(gòu)分析及其功能進(jìn)展，并對未來相關(guān)領(lǐng)域研究進(jìn)行了展望，為多粘類芽孢桿菌胞外多糖的綜合應(yīng)用以及進(jìn)一步研究提供參考。

　　1 菌株來源

　　多粘類芽孢桿菌在自然界中分布廣，廣泛分布于土壤、植物的體表以及根部，也是常見的植物內(nèi)生菌。目前，多粘類芽孢桿菌多從植物的根際土壤中分離而來。劉訓(xùn)理[10]等從泰山土壤中分離得到1株對多種動植物病原細(xì)菌和真菌具有較強拮抗作用的多粘芽孢桿菌Cp-s316。陳雪麗[11]等從大豆根際土壤中分離得到多粘芽孢桿菌BRF-1。張道敬[12]等在番茄的根際土壤中分離得1株生防菌株多粘芽孢桿菌HY96-2。林茂茲[13]等從太子參根際土壤中篩選出對尖孢鐮刀菌有很強抑制作用的多粘類芽孢桿菌S960。張宏福[14]等從中華蘆薈中分離到1株植物內(nèi)生菌多粘類芽孢桿菌A11，并且對該菌進(jìn)行了全基因組測序。吳棣[15]等自中國貴州辣椒根際土壤中分離得一株具有良好的拮抗性能并具有較好的植物促生及溶磷、解鉀的能力的多粘類芽孢桿菌SC2。鄂垚瑤[16]等從西瓜種植發(fā)病區(qū)健康植株根際分離得到的一株兼具促生及生防功能的根際有益菌多粘類芽孢桿菌SQR-21。李玉洋[17]等從水稻根際土壤中篩選得到1株對水稻惡苗病菌拮抗作用較強的多粘類芽孢桿SH15。王波[18]等從大豆植株中分離得到多粘類芽孢桿菌XZ-2。

　　2 發(fā)酵工藝

　　在發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件對胞外多糖的合成至關(guān)重要，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件促進(jìn)菌體生長及其生理代謝，是提高胞外多糖產(chǎn)量的重要手段，成為優(yōu)化多糖生產(chǎn)工藝的研究熱點。優(yōu)化發(fā)酵工藝通常使用單因素試驗、正交試驗、響應(yīng)面設(shè)計方法相結(jié)合，綜合探究不同因素之間的交互作用。

　　2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化 培養(yǎng)基組分在很大程度上影響著微生物生長及其代謝產(chǎn)物的積累，適合菌體生長繁殖的培養(yǎng)基不一定適合于代謝產(chǎn)物的積累。不同的菌株對碳源、氮源、生長因子和無機鹽離子等營養(yǎng)物質(zhì)種類和濃度的要求大有不同，不同代謝物的產(chǎn)生對這些要求也不同。因此，為提高多糖產(chǎn)率，需對培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。碳源不僅是微生物菌體的能源物質(zhì)，也是合成菌體和目的產(chǎn)物的碳成分提供者。碳源對菌體產(chǎn)多糖的數(shù)量和質(zhì)量起著關(guān)鍵作用。不同的碳源對微生物的生長及其多糖的合成有一定的影響。氮源是細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等)和含氮代謝物的組分，是菌體生長繁殖的必需營養(yǎng)素，為微生物生長提供營養(yǎng)所需的氮元素，也是合成多糖的重要成分，適宜的氮源及添加量有利于多糖的合成。無機鹽及微量元素是微生物生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物，一般在低濃度有促進(jìn)作用，在高濃度有抑制作用。不少研究表明，對于多粘類芽孢桿菌產(chǎn)多糖，蔗糖是最佳碳源。如劉俊等[19]先用單因素實驗方法篩選影響胞外多糖的產(chǎn)量因子，再用響應(yīng)面法對碳源、氮源和無機鹽的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳培養(yǎng)基組合為蔗糖188.2g/mL、酵母膏25.8g/mL、氯化鈣0.34g/mL，其提取量高達(dá)35.26g/L。蹇華麗等[21]采用單因素實驗法，以多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，對多粘類芽孢桿菌PS04發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，最終確定蔗糖是最佳碳源，最適濃度150g/L，最佳氮源為無機氮NH4NO3，最適濃度1.4g/L。王波[18]等采用單因素試驗和正交試驗相結(jié)合的方法對多粘類芽孢桿菌XZ-2的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化研究，得出利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)糖量最高，其最佳培養(yǎng)基組成為蔗糖15g/L、蛋白胨15g/L、硫酸鎂5g/L、氯化鈣3g/L。

　　2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化 微生物的正常生長繁殖，需要適應(yīng)的環(huán)境。在胞外多糖發(fā)酵生產(chǎn)中，除培養(yǎng)基的成分及濃度外，培養(yǎng)溫度、初始pH、發(fā)酵時間、通氣量、接種量等工藝條件也是主要的影響因素。只有將這些外界條件控制在適合菌種發(fā)酵的最優(yōu)水平，才能提高多糖的產(chǎn)量。溫度是影響微生物生長的重要因素，它會影響菌中的酶活性，進(jìn)而會影響微生物體內(nèi)所進(jìn)行的各種生化反應(yīng)，對微生物的影響是最為廣泛的。在一定范圍內(nèi)，適宜的溫度促進(jìn)菌體生長，促進(jìn)代謝活性物質(zhì)的產(chǎn)生;不適的溫度則會影響微生物的代謝。pH值也會影響菌中酶的活性，直接影響菌類的正常生長和代謝，pH過高或過低均會影響多糖產(chǎn)量。到目前為止，已有不少關(guān)于多粘類芽孢桿菌產(chǎn)多糖培養(yǎng)條件的報道。楊樹麗[20]采用單因素試驗法確定了類芽孢桿菌C-12菌株的最佳發(fā)酵條件為溫度30℃，初始pH6.0，轉(zhuǎn)速160r/min，接種量6%。蹇華麗[21]采用單因素法和響應(yīng)面設(shè)計對菌株P(guān)S04發(fā)酵產(chǎn)多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終得出初始pH值為8.22、發(fā)酵溫度37℃、接種量4%、發(fā)酵周期48h時，多糖產(chǎn)量可達(dá)到60.04g/L，約為發(fā)酵條件未優(yōu)化時產(chǎn)量的6倍。表明通過響應(yīng)面設(shè)計方法對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化可以明顯提高多糖的產(chǎn)率。楊棒棒[22]等在類芽孢桿菌ZX-5產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化中，先對碳源、氮源、溫度、pH、碳濃度、氮濃度進(jìn)行單因素試驗，得出溫度、碳源濃度、氮源濃度對產(chǎn)多糖具有顯著影響，再選用這3個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗，分析多糖產(chǎn)量的交互作用，得到最佳的產(chǎn)糖溫度條件為20℃，在優(yōu)化條件下產(chǎn)糖量達(dá)到34.55g/L，是基礎(chǔ)水平的2.01倍。

　　3 提取與純化

　　目前，微生物胞外多糖的提取一般采用離心除菌體、有機溶劑沉淀、去除蛋白、透析、冷凍干燥等步驟得多糖粗品，其純度較低，常含有色素、蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)等雜質(zhì)。雜質(zhì)的存在不僅降低了多糖的純度，也影響對其結(jié)構(gòu)與生物活性的研究。利用凝膠柱層析、離子交換柱層析等手段進(jìn)行純化，可得到純度較高的多糖樣品。

　　3.1 提取 多粘類芽孢桿菌多糖為胞外產(chǎn)物，分離過程一般先要去除菌體。高速離心是除菌體最常用的方法。然而，多糖的高粘度性會使發(fā)酵液難于離心，因此，有研究者采用先稀釋發(fā)酵液再離心的方法，也有研究者在處理發(fā)酵液前先加熱發(fā)酵液[23]。加熱會使結(jié)合在細(xì)胞壁上的多糖脫離細(xì)胞，同時使蛋白質(zhì)變性沉淀[24]。因此，發(fā)酵液先經(jīng)熱處理，再冷卻稀釋離心更適合高粘度的多粘類芽孢桿菌發(fā)酵液中多糖的提取。用乙醇沉淀是最常用的多糖提取方式[25]。不同菌株發(fā)酵液中多糖的提取率與乙醇的濃度有很大影響。如賈杰[26]等用1倍體積的乙醇沉淀多粘類芽孢桿菌HY96-2胞外多糖。田文祥[27]等用3倍體積的95%乙醇沉淀多粘類芽孢桿菌PS04胞外多糖。有機溶劑在低溫下可提高其沉淀量，促進(jìn)沉淀速度，所以多數(shù)研究者使用有機溶劑時先經(jīng)預(yù)處理再沉淀，或是在低溫條件下進(jìn)行沉淀。

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