摘要 肝素的結(jié)構(gòu)通常以不同的二糖單位表示，了解肝素二糖的組成有助于從微觀結(jié)構(gòu)上解析肝素的作用機(jī)理。采用肝素酶1、1、混合，在合適的溫度及緩沖液條件下，共同酶解肝素溶液，肝素酶解后得到的二糖及寡糖由于其磺酸化程度的不同因而在陰離子交換柱上保留的程度不同，已達(dá)到分離的效果，通過(guò)二糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)肝素酶解后的二糖及寡糖進(jìn)行定位，進(jìn)而確認(rèn)肝素酶解后不同糖的構(gòu)成比例。結(jié)果表明，肝素結(jié)構(gòu)測(cè)定檢測(cè)方法具有較好的精密度，在分別改變柱溫、體積流量時(shí)具有較好的耐用性，該檢驗(yàn)方法可用于肝素二糖結(jié)構(gòu)的解析。

　　關(guān)鍵詞 肝素鈉;二糖;肝素酶：陰離子交換

　　肝素鈉是黏多糖硫酸酯類(lèi)抗凝血藥[，由豬或牛的腸黏膜中提取獲得，近年來(lái)研究證明肝素鈉還有降血脂作用。肝素由一個(gè)糖醛酸和一個(gè)葡糖氨組成的二糖交替形成的線狀硫酸化的多糖，隸屬于糖胺聚糖家族。組成肝素的醛酸為L(zhǎng)-艾杜醛酸(HdoA)和D-葡萄糖醛酸(GleA)，而氨基糖為D-氨基葡萄糖(GleN)，IdoA和GleN通過(guò)a+，4糖苷鍵進(jìn)行連接，而GlcA則通過(guò)B-，4糖苷鍵進(jìn)行連接[2.GleN普遍地以N-硫酸化的形式存在于肝素中，但少數(shù)序列中含有N乙酰化(Acetyl)的GleN。幾乎所有的醛酸和氨基糖都有0疏酸基團(tuán)。肝素的結(jié)構(gòu)通常以不同的二糖單位表示，而其中最主要的是三磺酸化的二糖(TSD)：IdoA2503-Gle-

　　N5036503，其葡萄糖胺片段主要是N-疏酸化的。肝素鈉經(jīng)肝素酶酶解成二糖、四糖等不同的寡糖結(jié)構(gòu)，通過(guò)陰離子交換柱分離呈現(xiàn)肝素中不同的寡糖比例，從而了解肝素的組成成分。

　　1儀器與試藥

　　1.1儀器與器具

　　高效離子色譜儀(Dionex ICS5000，編號(hào)F079);電子分析天平(梅特勒托利多XS204，AB265-與，編號(hào)H020);移液器(規(guī)格100 ~1 000 L，編號(hào)YP26：規(guī)格20 ~200L，編號(hào)YP31)。

　　1.2 試劑與試藥

　　磷酸二氫鈉、高氯酸鈉、磷酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，分析純磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、醋酸鈣、醋酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)：分析純牛血清蛋白(Sigma公司)。肝素酶1、11、111蘇州國(guó)銷(xiāo)醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)分別為20130801，20130802，20130803);肝素二糖(來(lái)源：Dextra科技公司，A IA：批號(hào)CCDX69-

　　163A：AII A：批號(hào)CCDX69498：A II A：批號(hào)CCDX6947B;ANA：批號(hào)CCDX69-81B;A IS：批號(hào)CCDX111-52;AI1：批號(hào)CCDX69490;A II：批號(hào)CCDX69-74B;AIVS：批號(hào)CCDX111-81A)。

　　2測(cè)試方法

　　2.1 測(cè)試原理

　　該檢驗(yàn)方法采用肝素酶1、11、1混合，在合適的溫度及緩沖液條件下，共同酶解肝素溶液，肝素酶解后得到的二糖及寡糖由于其磺酸化程度的不同因而在陰離子交換柱上保留的程度不同，已達(dá)到分離的效果，通過(guò)二糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)肝素酶解后的二糖及寡糖進(jìn)行定位，進(jìn)而確認(rèn)肝素酶解后不同糖的構(gòu)成比例。

　　2.2色譜條件

　　分析柱：戴安lonPac AS11-HC，4 mm*250 mm，編號(hào)117;保護(hù)柱：戴安IonPac AG11HC，4 mm*50 mm，編號(hào)116：流動(dòng)相A：稱(chēng)取0.280 g磷酸二氫鈉溶于950 mL純化水中，用磷酸調(diào)pH至3.0，后用純化水稀釋至1000 mL，0.22 um濾膜濾過(guò)。流動(dòng)相B：稱(chēng)取140 g高氯酸鈉溶于950 mlL.流動(dòng)相A中，用磷酸調(diào)pH至3.0，后用流動(dòng)相A稀釋至1 000 mL，0.22 um濾膜濾過(guò)。檢測(cè)波長(zhǎng)：234 nm;體積流量：0.45 mL/min;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10LL：梯度洗脫條件見(jiàn)表1

　　2.2.1 測(cè)試用溶液 pH 7.0乙酸鈣溶液：稱(chēng)取32 mg乙酸鈣和10 mg牛血清蛋白溶于60 ml.純化水中，加入580 L冰乙酸，定容至100ml.

　　pH 7.0磷酸二氫鉀緩沖液：稱(chēng)取68mg磷酸二氫鉀和10 mg牛血清蛋白溶于30 ml.純化水中，定容至50 mL。硼氫化鈉溶液：稱(chēng)取12mg硼氫化鈉溶于400u純化水。肝素酶1溶液：用pH 7.0磷酸二氫鉀緩沖液溶解稀釋肝素酶1使成0.4 U/mL.肝素酶11溶液：用pH 7.0磷酸二氫鉀緩沖液溶解稀釋肝素酶11使成0.4 1U/mL.肝素酶ⅢI溶液：用pH 7.0磷酸二氫鉀緩沖液溶解稀釋肝素酶I使成0.4 1U/mlL.肝素酶1，11，1溶液：肝素酶1溶液、肝素酶11溶液、肝素酶ⅢI溶液1：1：1混合。二糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：將Al A.AIIA.AIIA.ANA.A IS，AIIS、AIISAIS8種二糖分別用純化水配制成0.25 mg/mL的溶液。空白溶液：吸取20 uL.純化水、70 uL pH7.0乙酸鈣溶液及100 uL肝素酶1，11，1溶液混合，制成混合溶液。對(duì)照品溶液：稱(chēng)取適量肝素鈉對(duì)照品，制成濃度為20 mg/mlL的水溶液：吸取20 uL該溶液，分別加入70 uL pH7.0乙酸鈣溶液及100肝素酶1，11，I溶液混合，制成混合溶液。供試品溶液：稱(chēng)取適量肝素鈉供試品，制成濃度為20 mg/mL的水溶液;吸取20山該溶液，分別加入70uL pH7.0乙酸鈣溶液及100山肝素酶1，I1，1溶液混合，制成混合溶液。

　　2.2.2 肝素中寡糖含量的確定 取二糖溶液、空白溶液、供試品溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。

　　根據(jù)二糖溶液色譜圖中二糖的出峰位置確認(rèn)供試品中各峰，另出峰時(shí)間為9.5 min和23.5 min左右的分別為L(zhǎng)R峰和四糖峰。

　　將已定位出的各個(gè)寡糖進(jìn)行磺酸化程度的分類(lèi)：分為一磺酸化區(qū)、二磺酸化區(qū)和三磺酸化區(qū)，根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及LR和四糖峰面積占總峰面積的比例，以此比例視為各組分的含量。

　　3結(jié)果分析

　　3.1重復(fù)性

　　按2.2.1配制供試品溶液，供試品溶液配制6份，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算供試品溶液中LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量。

　　測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。

　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)員(A)6份供試品溶液測(cè)得LR含量的RSD為6.1%、一磺酸化二糖含量的RSD為2.2%、二磺酸化二糖含量的RSD為0.6%、三磺酸化二糖含量的RSD為0.5%及四糖含量的RSD為0.3%，均小于10.0%，符合規(guī)定，重復(fù)性測(cè)試通過(guò)。

　　3.2 中間精密度

　　由實(shí)驗(yàn)員(B)對(duì)同一批肝素鈉供試品進(jìn)行測(cè)試，重新配制對(duì)照品溶液及6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量。

　　實(shí)驗(yàn)員(B)6份供試品溶液測(cè)得LR含量的RSD為3.4%、一磺酸化二糖含量的RSD為0.5%、二磺酸化二糖含量的RSD為0.5%、三磺酸化二糖含量的RSD為0.5%

　　及四糖含量的RSD為1.0%，均小于10.0%。

　　實(shí)驗(yàn)員(A)和(B)之間測(cè)得LR含量的RSD為6.2%.

　　一磺酸化二糖含量的RSD為1.8%、二磺酸化二糖含量的RSD為0.6%、三磺酸化二糖含量的RSD為0.7%及四糖含量的RSD為0.7%，均小于15.0%。

　　3.3耐用性

　　3.3.1 溶液穩(wěn)定性 將對(duì)照品溶液和供試品溶液室溫放置，放置0，6，12，24 h后分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4，表5

　　結(jié)論：對(duì)照品溶液放置6h后，LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和0h測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為6.3%，0.9%，0.5%，0.1%，

　　0.7%;放置12 h后，測(cè)得含量和0h測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為6.3%，0.5%，0.4%，0.1%，0.7%;放置24 h后，測(cè)得含量和0h測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為

　　6.3%，1.7%，0.4%，0.2%，0.7%。供試品溶液放置6h后，LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和0h測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為4.7%，0%，0.1%，0.3%，1.3%;放置12h后，測(cè)得含量和0h測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為6.1%，0.8%，0.1%，0.4%，0.5%：放置24 h后，測(cè)得含量和0h測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為4.7%，

　　0.9%，0.4%，0.5%，1.3%.

　　對(duì)照品溶液與供試品溶液放置6，12，24 h后，LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和0h測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差均小于10.0%，符合規(guī)定，該測(cè)試表明對(duì)照品溶液及供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

　　3.3.2 改變體積流量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 將體積流量從0.45 mlL/min分別調(diào)整為0.40 mL/min和0.50 mL/min，充分平衡，取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表6，表7。

　　結(jié)論：體積流量0.40 mlL/min和0.50 ml/min時(shí)均符合系統(tǒng)適用性要求。體積流量0.40ml/min時(shí)，對(duì)照品溶液LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為6.3%，0.2%，0.6%，0.1%，1.7%，供試品溶液測(cè)得含量和標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為4.7%，

　　0.3%，0.5%，0.3%，1.3%;體積流量0.50 mlL/min時(shí)，對(duì)照品溶液LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為6.3%，1.3%，0.2%，0.2%，1.3%，供試品溶液測(cè)得含量和標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為4.7%，1.6%，0.3%，0.2%，1.8%，上述相對(duì)平均偏差均小于10.0%。

　　3.3.3 改變柱溫對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響 將柱溫從35 ℃分別調(diào)整為33 ℃和37 ℃，充分平衡，取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)表8，表9.

　　結(jié)論：柱溫33 ℃和37 ℃時(shí)均符合系統(tǒng)適用性要求。柱溫33℃時(shí)，對(duì)照品溶液LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為9.1%，0.8%，0.3%，0.1%，

　　0.9%，供試品溶液測(cè)得含量和標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為7.5%，0.5%，0%，0.5%，1.6%;柱溫37℃時(shí)，對(duì)照品溶液LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為9.1%，1.7%，0.2%，0.2%，0.7%，供試品溶液測(cè)得含量和標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得含量相比，相對(duì)平均偏差分別為6.1%，0.8%，0.3%，0.3%，0.9%，上述相對(duì)平均偏差均小于10.0%。

　　4討論

　　肝素結(jié)構(gòu)測(cè)定檢測(cè)方法具有較好的精密度，在分別改變柱溫、體積流量時(shí)具有較好的耐用性，該檢驗(yàn)方法滿足檢驗(yàn)要求，可以用于肝素結(jié)構(gòu)的測(cè)定。今后隨著該方法使用的深入，將繼續(xù)開(kāi)發(fā)改進(jìn)該方法，以滿足對(duì)肝素鈉二糖結(jié)構(gòu)檢測(cè)的質(zhì)控要求。

　　參考文獻(xiàn)

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　　[2]張震，低分子肝素的結(jié)構(gòu)確證研究[].中國(guó)新藥雜志，2014，23(08)：901905 +939.

　　Abstract The structure of heparin usually is represented by different disaccharide units. It can help learn the mechanism of heparin in the microstructure by analysis of disaccharide structure. Mix the heparin enzyme 1, I1, I to decompose the heparin solution with an appropriate temperature and buffer solution. The retention degrees of acquired disaccharide and oligosaccharide are different in the anion exchange column because of different sulfonation degrees. So disaccharide and oligosaccharide can be separated. Ensure the location of disaccharide and oligosaccharide by disaccharide standard then calculate the percentage of different disaccharide and oligosaccharide unit after enzymolysis. The result shows that this test method is with qualified precision and robustness when changing column temperature and flow rate. So this method can be used to analyze the disaccharide structure of heparin.

　　Key words Heparin sodium, Disaccharide structure, Heparin enzyme, Anion exchange

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文章名稱(chēng)： 肝素鈉二糖結(jié)構(gòu)高效液相檢測(cè)方法的研究

文章地址： http://www.ke-jian.com/mianfeiwx/56760.html