摘 要：白英含有多種化學成分，具有潛在的藥用價值和開發(fā)前景，但抗炎機制的研究并不完整。本實驗以小鼠RAW264.7細胞為材料，研究白英甾體化合物的抗炎作用機制，研究發(fā)現(xiàn)：白英甾體化合物能明顯抑制產生炎癥的小鼠RAW264.7細胞的TNF-α的炎癥因子的表達，提高炎癥細胞的線粒體膜電位，白英甾體化合物可能是通過保護線粒體來實現(xiàn)其抗炎作用。

　　關鍵詞：白英甾體化合物;TNF-α;線粒體膜電位;抗炎

　　炎癥是機體自發(fā)產生的一種正常反應，但如果反應過度，又會給機體帶來損傷。如何有效控制炎癥的過度損傷，減輕炎癥對身體帶來的危害，是如今所要研究的重要課題，對人類健康具有重要意義[1]。白英，又叫鬼目草、葫蘆草等，是茄科茄屬植物，屬多年生蔓性草本植物，分布十分廣泛[2]。白英有很大的藥用價值，其全草以及根部都可供藥用。目前臨床上對于白英的應用越來越多，在消腫解毒、抗腫瘤等方面尤為顯著。近年來，各研究學者開始對白英的抗炎作用進行研究，發(fā)現(xiàn)白英具有較好抗炎效果。研究表明，白英主要通過其各種化學成分發(fā)揮作用[3]。TNF-α是非常重要的一種炎癥因子，能夠反映細胞的炎癥水平，抑制TNF-α的表達，可以達到抗炎的目的。線粒體是真核生物非常重要的細胞器，在機體中發(fā)揮重要的作用，當機體產生炎癥時，線粒體會發(fā)生很明顯的變化，包括上調ROS水平、降低線粒體膜電位等，可以通過這些指標來觀察線粒體的情況，因此，研究白英甾體化合物的抗炎作用與對線粒體的關系具有重要意義。

　　1 材料

　　1.1 儀器

　　細胞培養(yǎng)箱;超凈工作臺;酶標儀;倒置顯微鏡;電子天平;低速離心機;熒光顯微鏡等。

　　1.2 試劑

　　DMEM培養(yǎng)基;胎牛血清;PBS;雙抗;CCK-8試劑;TNF-α的ELISA檢測試劑盒;線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)。

　　1.3 藥品與細胞

　　白英甾體化合物干粉由吉林省中醫(yī)中藥研究院饋贈，利用PBS使其溶解，實驗所需細胞為小鼠RAW264.7細胞購自中國細胞庫，對照組為地塞米松。

　　2 方法

　　2.1 藥品配制及細胞培養(yǎng)

　　取白英甾體化合物的干粉，用PBS將其溶解，然后過濾并進行高壓滅菌。小鼠RAW264.7細胞用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，加入胎牛血清和雙抗(青霉素、鏈霉素)，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數生長期可供實驗使用。

　　2.2 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞活力的影響

　　取培養(yǎng)的小鼠RAW264.7細胞，加入培養(yǎng)基并輕輕吹打，使細胞懸浮到液體中，加入到96孔板中，使每孔體積200μL，細胞密度為1×104mL/個，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁生長，然后把孔內液體吸出，加入含有不同濃度的白英甾體化合物的DMEM培養(yǎng)基，并加入LPS，分為5組：空白組，白英甾體化合物高、中、低劑量組(白英甾體化合物的濃度分別為40μg·mL-1、20μg·mL-1、5μg·mL-1)，地塞米松陽性對照組[4]。

　　2.3 CCK-8法測定細胞活力

　　上述5組作用24h后，每孔加入10μLCCK-8，靜置30min，把酶標儀的波長調至450nm，測定上述各孔吸收的OD值。

　　2.4 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞TNF-α表達的影響

　　細胞培養(yǎng)同上所述，分組情況同上，按照TNF-α的ELISA檢測試劑盒的說明書進行操作，測量小鼠RAW264.7的炎癥因子的表達情況。

　　2.5 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響

　　在上述培養(yǎng)的細胞中，加入脂多糖，按照分組濃度，加入白英甾體化合物，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每組取1×105個細胞，重懸于0.5mL細胞培養(yǎng)液中，按照線粒體膜電位檢測試劑盒的說明書進行操作，以測定線粒體膜電位的變化情況[5]。

　　2.6 數據的統(tǒng)計分析

　　使用Graphpad Prism 5.0軟件對試驗數據進行統(tǒng)計學分析。

　　3 結果

　　3.1 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞活力的影響

　　結果顯示，與空白組相比較，白英甾體化合物的高中低劑量組和陽性對照組細胞活性明顯偏低，白英甾體化合物的高中低劑量組又高于地塞米松組，但各組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。說明在試驗濃度范圍內，不同濃度的甾體化合物和地塞米松不影響小鼠RAW264.7細胞活性，對小鼠RAW264.7細胞沒有毒性作用，與林世和等研究結果一致[6]。

　　3.2 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞TNF-α表達的影響

　　結果顯示，與空白組比較，LPS顯著提升了小鼠RAW264.7細胞TNF-α的表達，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明LPS誘導細胞產生炎癥，模型構建成功。與LPS組比較，40μg·mL-1和20μg·mL-1的甾體化合物與地塞米松能夠抑制小鼠RAW264.7細胞TNF-α的表達，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明白英甾體化合物具有較好的抗炎作用。5μg·mL-1的甾體化合物則沒有顯示出抑制小鼠RAW264.7細胞TNF-α的表達的作用，對比LPS組，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明白英甾體化合物濃度較低時，其作用效果不明顯，與劉淑華等研究結果一致[4]。

　　3.3 白英甾體化合物對小鼠RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響

　　通過JC-1法測定線粒體膜電位，用紅、綠2種顏色的熒光分別表示線粒體膜電位的高、低。結果顯示，空白組呈現(xiàn)紅色熒光，LPS組為綠色熒光，說明在LPS的刺激下，細胞產生炎癥;當加入白英甾體化合物后，線粒體膜電位有所提高，并且以劑量依賴性的方式增強線粒體膜電位，說明炎癥反應得到抑制。

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