摘 要：黃薇Heimia myrtifolia是具有較高價值的引種植物，但對其引種后的適應性研究仍較缺乏。為了探究黃薇對高溫干旱及協同脅迫的響應，采用人工模擬自然狀態下干旱(對照、輕度干旱、中度干旱和重度干旱)，高溫(30, 36和42℃)及高溫干旱協同脅迫對黃薇葉片抗氧化防御系統的影響。結果顯示：干旱脅迫下，過氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)質量摩爾濃度顯著增加(P<0.05)，脂膜過氧化程度加深，抗壞血酸-谷胱甘肽(AsAGSH)循環相關酶活性和相關還原物質均呈先上升后下降趨勢，在中度脅迫下達到頂峰，與對照相比均顯著增加(P<0.05)。高溫脅迫下，抗氧化酶效率和AsA-GSH循環效率均有提高。高溫干旱協同脅迫下，黃薇受到的傷害明顯大于單一脅迫，超氧化物歧化酶(SOD)和POD顯著上升(P<0.05)并于中度脅迫時達到頂峰，MDA質量摩爾濃度顯著增加(P<0.05), AsA-GSH循環效率均有提高但在中度脅迫下開始下降，脂膜過氧化隨著脅迫加深顯著加劇，重度脅迫下已無法維持正常生長。黃薇在高溫干旱脅迫下可以通過調節抗氧化酶系統和AsA-GSH循環共同清除氧化物質，提高抗脅迫能力，維持正常生長發育。
關鍵詞：植物學; 黃薇; 高溫; 干旱; 抗氧化酶; 抗壞血酸-谷胱甘肽循環;
《中國牦牛》是目前國內外唯一的牦牛學科專業刊物。1979年經農墾部批準,四川省出版事業管理局核準發給期刊登記證,于1980年正式創刊發行;1988年全國報刊整頓重新登記時,本刊又經農業部審核批準由部主。
黃薇Heimia myrtifolia為千屈菜科Lythraceae黃薇屬Heimia的落葉灌木[1],原產南美洲和非洲的熱帶、亞熱帶地區,人類的遷移致使南亞、東亞地區有零星分布[2],為中國引種植物。其花色金黃,夏季開花,花量豐富,花期較長,觀賞價值極高。此外,黃薇植株可塑性強,繁殖簡便,生長迅速,具有耐高溫、耐水濕和耐輕微干旱的特性,抗逆能力強,生態適應性廣,是一種待開發的優良觀賞植物。迄今為止,關于黃薇生態適應性的研究國內外未見報道。黃薇原生環境夏季高溫多雨,冬季少雨。目前,中國引種地區夏季易出現高溫天氣并伴隨干旱發生,在兩者的共同作用下,植物的生長和發育會受到較大的影響,甚至無法恢復導致植株死亡[3]。研究表明:植物遭受脅迫后體內的活性氧含量會不斷積累,過量的活性氧一方面會導致生物膜脂過氧化,形成有害物質;另一方面會破壞植株葉綠體結構,削弱光合作用能力,對植物造成傷害[4]。植物會依靠植株體內的酶促和非酶促兩大類保護系統對過量的活性氧進行清除,以維持正常代謝和減輕受到的損傷[5,6]。酶促清除系統主要包括超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT),抗壞血酸過氧化物酶(APX)及作用范圍較廣的過氧化物酶(POD),還包括保持抗氧化物質還原性所必須的酶如抗壞血酸—谷胱甘肽循環酶類等;非酶促清除系統主要包括抗壞血酸(AsA),類胡蘿卜素及一些含巰基的低分子化合物(如還原型谷胱甘肽GSH)等物質[6]。本研究通過研究高溫干旱脅迫對黃薇抗氧化酶活性和抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環的影響,探究高溫干旱脅迫下黃薇抗氧化系統的響應機制,以期揭示黃薇在高溫干旱脅迫下的耐脅迫能力,進而為黃薇的推廣和栽培提供理論依據。
1 材料與方法1.1 實驗材料與處理實驗材料為1年生黃薇扦插苗,于2017年4月選擇健壯枝條扦插于浙江農林大學風景園林與建筑學院溫室中,當年7月移栽入塑料花盆(12.0 cm×8.8 cm×10.8 cm)中,栽培基質為m(泥炭土)∶m(蛭石)∶m(珍珠巖)=2∶1∶1的混合基質。2018年4月,選擇健壯、長勢基本一致的苗采用相同基質定植于塑料花盆(16.0 cm×11.0 cm×14.0 cm)中,當年6-7月放入人工氣候箱(寧波萊福,中國)進行處理,處理前在人工氣候箱中適應性培養7-10 d。模擬自然高溫干旱條件下土壤水分不斷流失并無法補充的過程對實驗材料的影響。實驗時采用人工氣候箱精確控制溫度,分為3個溫度梯度進行處理:T1(30℃/22℃),T2(36℃/26℃)和T3(42℃/30℃),15盆·組-1,光周期為12 h光照/12 h黑暗,光合有效輻射為240μmol·m-2·s-1。
每日早中晚使用便攜式土壤水分測定儀(Spectrum公司,美國)對每盆苗進行土壤含水量測定,水分分為4個梯度:正常狀態(對照,70%～80%田間持水量),輕度干旱(LD,55%～65%田間持水量),中度干旱(MD,35%～45%田間持水量),重度干旱(HD,10%～30%田間持水量)。根據測定,當每個溫度梯度到達相應田間持水量時選取中上部完整的功能葉進行抗氧化系統相關指標測定。
1.2 測定指標及方法
1.2.1 抗氧化酶活性和丙二醛質量摩爾濃度測定超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑法[7]、過氧化物酶(POD)采用愈創木酚法[7]、丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法[7]、過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法[7]。
1.2.2 AsA-GSH循環相關物質和酶活性測定抗壞血酸(AsA)和脫氫抗壞血酸(DHA)質量摩爾濃度測定采用二聯吡啶法[8],氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)質量摩爾濃度測定參考NAGALAK-SHMI等[9]的DTNB循環檢測法。抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定參考NAKANO等[10]的方法,單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性測定采用KRIVOSHEEVA等[11]的方法,谷胱甘肽還原酶(GR)活性和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性采用試劑盒(蘇州科銘,中國)進行測定。
1.3 數據處理將數據分為高溫脅迫、干旱脅迫和高溫干旱脅迫3組,使用SPSS Stastics 18(IBM,美國)進行方差分析。
2 結果與分析
2.1 高溫干旱脅迫對黃薇SOD,POD,CAT活性和MDA質量摩爾濃度的影響高溫脅迫下黃薇葉片SOD活性,在輕度干旱和中度干旱下呈上升趨勢,在重度干旱和對照組中呈現下降趨勢,但變化不顯著(P>0.05);干旱脅迫下黃薇葉片SOD活性隨著干旱程度的增加,呈先上升后下降的趨勢,且于中度干旱下達到最大;協同脅迫下在中度干旱時達到峰值,為對照的125.0%(P<0.05)(圖1A)。高溫脅迫下黃薇葉片POD活性隨著溫度的增加而呈現上升趨勢,且變化顯著,42與30℃相比較,對照、輕度干旱、中度干旱、重度干旱4個水分組分別增加了49.1%(P<0.05),99.0%(P<0.05),89.1%(P<0.05)和173.5%(P<0.05);干旱脅迫下,POD活性隨著脅迫程度呈先上升后下降的趨勢,且變化顯著,在中度干旱時值達到最大,與對照相比分別增加31.7%(P<0.05),53.0%(P<0.05)和67.1%(P<0.05);協同脅迫下在中度脅迫時達到峰值,為42℃干旱對照組的167.1%(P<0.05)(圖1B)。高溫脅迫下黃薇葉片CAT活性隨著溫度的增加而呈現上升趨勢,且變化顯著,42與30℃相比較,對照、輕度干旱、中度干旱、重度干旱分別增加了68.1%(P<0.05),42.5%(P<0.05),23.7%(P<0.05)和131.3%(P<0.05);干旱脅迫下,CAT活性在30和36℃時隨著脅迫程度呈先上升后下降的趨勢,在中度干旱時值達到最大,分別為增加了40.1%(P<0.05)和4.1%(P>0.05),42℃呈現上升趨勢但變化不顯著;協同脅迫下在重度干旱時達到峰值,為42℃干旱對照組的104.6%(P>0.05)(圖1C)。高溫脅迫下黃薇葉片MDA質量摩爾濃度隨著溫度的增加而呈現先下降后上升的趨勢,在重度脅迫時達到峰值,且變化顯著(P<0.05);干旱脅迫下MDA都呈現上升趨勢,于重度脅迫下達到峰值,與對照相比分別增加了133.4%(P<0.05),117.5%(P<0.05)和79.6%(P<0.05)(圖1D)。
2.2 高溫干旱脅迫對黃薇AsA及DHA質量摩爾濃度的影響高溫脅迫下黃薇葉片AsA質量摩爾濃度隨著溫度的增加呈現不同的趨勢,均無顯著變化(P>0.05);干旱脅迫下,AsA質量摩爾濃度在30和36℃時隨著脅迫程度呈先上升后下降的趨勢,在輕度干旱時值達到最大,重度干旱時值最小,重度干旱脅迫比對照組分別減少19.3%(P>0.05)和37.4%(P<0.05);協同脅迫下AsA質量摩爾濃度隨脅迫程度逐漸下降,重度干旱脅迫時與42℃干旱對照組相比減少了38.2%(P<0.05)(圖2A)。高溫脅迫下黃薇葉片DHA質量摩爾濃度隨著溫度的增加而呈現不同的趨勢,對照、輕度干旱、中度干旱3組呈現先上升后下降趨勢,重度干旱組呈現上升趨勢;干旱脅迫下,DHA質量摩爾濃度在30和36℃時隨著脅迫程度呈先上升后下降的趨勢,在中度干旱時達最大值,分別增加了162.5%(P<0.05)和115.4%(P<0.05);協同脅迫下DHA質量摩爾濃度隨脅迫程度逐漸上升,重度干旱脅迫時與42℃干旱對照組相比增加了115.8%(P<0.05)(圖2B)。AsA/DHA比值在高溫脅迫下隨著溫度的增加呈不同趨勢,均無明顯差異性;干旱脅迫下,AsA DHA比值隨著脅迫程度均呈下降趨勢,在重度干旱分別減少了68.8%(P<0.05),65.3%(P<0.05)和72.6%(P<0.05)(圖2C)。
2.3 高溫干旱脅迫對黃薇GSH及GSSG質量摩爾濃度的影響高溫脅迫下黃薇葉片GSH質量摩爾濃度隨著溫度的增加而呈不同趨勢,對照、中度干旱、重度干旱3組呈現先上升后下降趨勢,各組內差異顯著(P<0.05),輕度干旱組呈現上升趨勢,差異不顯著;干旱脅迫下,GSH質量摩爾濃度隨著脅迫程度呈現先上升后下降的趨勢,在30和36℃時在中度干旱時達最大值;協同脅迫下GSH質量摩爾濃度隨脅迫程度先上升后下降,重度干旱脅迫時與42℃干旱對照組相比減少了58.8%(P<0.05)(圖3A)。高溫脅迫下黃薇葉片GSSG質量摩爾濃度隨著溫度的增加而呈現不同的趨勢,對照組和輕度干旱組呈現先下降后上升趨勢,中度干旱組和重度干旱組呈現下降趨勢;干旱脅迫下,在30和36℃時GSSG質量摩爾濃度隨著脅迫程度上升而上升,在重度干旱時達最大值,分別增加了46.0%(P<0.05)和52.4%(P<0.05);協同脅迫下GSSG質量摩爾濃度隨脅迫程度先上升后下降,中度干旱脅迫時達最大值,與42℃干旱對照組相比增加了26.4%(P<0.05)(圖3B)。GSH/GSSG比值在高溫脅迫下隨著溫度升高呈現先上升后下降的趨勢,于36℃達最大值,42℃達最小值,兩者相比各組分別減少了27.8%(P<0.05),21.3%(P<0.05),33.3%(P<0.05)和40.1%(P<0.05);干旱脅迫下,GSH/GSSG比值隨著脅迫程度均呈現下降的趨勢,在重度干旱分別減少了28.8%(P<0.05),37.5%(P<0.05)和48.1%(P<0.05)(圖3C)。
2.4 高溫干旱脅迫對黃薇APX,GR,DHAR,MDHAR活性的影響高溫脅迫下黃薇葉片APX活性隨著溫度的增加而呈現不同的趨勢,對照組和輕度干旱組呈上升趨勢,中度干旱組和重度干旱組呈先上升后下降趨勢,各組差異性均較顯著;干旱脅迫下,APX活性均呈先上升后下降的趨勢,在30和36℃時在中度干旱時達最大值,分別增加了60.0%(P<0.05)和208.3%(P<0.05);協同脅迫下APX活性于輕度干旱脅迫時達到最大值,與42℃干旱對照組相比增加了8.7%(P>0.05)(圖4A)。高溫脅迫下黃薇葉片GR活性隨著溫度的增加而呈現不同的趨勢,對照組、輕度干旱組呈上升趨勢,中度干旱組呈下降趨勢,重度干旱組呈先下降后上升趨勢,各組差異性均顯著;干旱脅迫下,GR活性均呈先上升后下降的趨勢,在30和36℃時,中度干旱下達最大值,分別增加了128.3%(P<0.05)和71.8%(P<0.05);協同脅迫下GR活性于輕度干旱脅迫時達到最大值,與42℃干旱對照組相比增加了28.7%(P<0.05)(圖4B)。
高溫脅迫下黃薇葉片DHAR活性隨著溫度的增加而呈不同趨勢,對照組呈先上升后下降趨勢,輕度干旱組、中度干旱組、重度干旱組呈現先下降后上升趨勢,除重度干旱組外各組差異性均較顯著;干旱脅迫下,DHAR活性均呈先上升后下降的趨勢,在30和36℃時,中度干旱下達最大值,分別增加了69.4%(P<0.05)和47.2%(P<0.05);協同脅迫下DHAR活性于輕度干旱脅迫時達到最大值,與42℃干旱對照組相比增加了145.0%(P<0.05)(圖4C)。高溫脅迫下黃薇葉片MDHAR活性隨著溫度的增加而呈不同趨勢,中度干旱組呈先上升后下降趨勢,對照、輕度干旱、重度干旱3組呈先下降后上升趨勢,中度干旱組和重度干旱組差異較顯著;干旱脅迫下,MDHAR活性均呈現先上升后下降的趨勢,在30和36℃時,中度干旱下達最大值,分別增加了150.0%(P<0.05)和561.5%(P<0.05);協同脅迫下MDHAR活性于輕度干旱脅迫時達到最大值,與42℃干旱對照組相比增加了100.0%(P<0.05)(圖4D)。
3 討論植物體內活性氧的產生與清除始終處于一種動態平衡,植物在遭受逆境時會產生并積累大量的活性氧導致動態平衡被打破,造成活性氧代謝失調[12]。植物剛遭受到逆境脅迫時,會通過增加體內抗氧化酶的活性來減輕活性氧造成的傷害,但隨著脅迫加深活性氧的增加和積累,抗氧化酶活性下降,多余的活性氧無法被清除而導致植物體受到不可逆的傷害[13]。高溫脅迫往往伴隨干旱脅迫同時發生,多重脅迫對植物的傷害明顯大于單一脅迫[14]。本研究中,單一脅迫下SOD,POD和CAT活性總體上呈增加趨勢,高溫脅迫下的增幅高于干旱脅迫,說明黃薇對高溫脅迫更加敏感;高溫干旱協同脅迫下,3種酶活性總體高于單一脅迫,POD活性的變化明顯較SOD和CAT活性顯著,說明POD是黃薇對抗高溫干旱脅迫的主要氧化酶;MDA質量摩爾濃度隨著脅迫程度增加而顯著增加且明顯高于單一脅迫,表明協同脅迫下活性氧對植物細胞膜產生的傷害較大。裴斌等[15]對沙棘Hippophae rhamnoides的干旱脅迫研究表明:SOD,POD和CAT活性隨著脅迫程度呈現先升后降的趨勢,其中SOD活性明顯高于POD和CAT活性,MDA質量摩爾濃度則是隨著脅迫程度而逐漸增加。干旱脅迫下,黃薇葉片中MDA質量摩爾濃度隨著脅迫程度增加而增加,3種酶活性雖都呈現先增強后下降趨勢,但SOD和CAT活性增強不明顯,POD的活性增強顯著,這與裴斌等[15]的研究結果不一致,可能是由于POD在活性氧的清除中效果較好。
高溫脅迫下,SOD,POD和CAT活性總體上呈現上升趨勢,POD和CAT活性增幅顯著,SOD活性增幅較小,這與周廣等[16]對井岡山杜鵑Rhododendron jinggangshanicum高溫脅迫的研究結果相似;MDA質量摩爾濃度總體呈先降后升趨勢,這與周廣等[16]的研究結果不同,可能是黃薇在高溫環境下具有一定的適應性,減緩了細胞膜脂質過氧化的速度。AsA-GSH循環是植物體內清除活性氧自由基的重要途徑[17],植物通過增加抗氧化劑含量和相關酶活性提高AsA-GSH循環的效率以適應環境脅迫[18]。
高溫干旱協同脅迫下,中度脅迫時黃薇葉片內APX活性相對平穩隨脅迫加重而下降,GR和MDHAR活性雖有增強但遠不如單一脅迫,而DHAR活性遠強于單一脅迫,黃薇葉片內DHA,GSH和GSSG質量摩爾濃度不斷顯著增加,AsA質量摩爾濃度不斷顯著下降,DHAR活性增強與DHA增加,AsA減少,這與韓一林等[18]和SILVA等[19]的研究結果不一致,可能因為DHAR活性雖然增加但循環仍以APX的清除優先,不能及時補充為AsA,故AsA質量摩爾濃度被大量消耗,無法及時得到補充從而不斷下降。重度協同脅迫下,植物細胞已經遭到破壞,各物質的量和酶的活性均下降,部分達到最低值,這與許馨露等[20]的研究結果相似。此外AsA/DHA比值和GSH GSSG比值隨著脅迫呈下降趨勢,表明脅迫造成AsA還原力不斷增強。單一干旱脅迫下,APX,GR,MDHAR和DHAR活性均呈先升高后下降的趨勢,這與董守坤等[21]的研究結果一致。
AsA,GSH和DHA質量摩爾濃度總體上呈現先增加后下降趨勢,GSSG質量摩爾濃度總體呈上升趨勢,實驗表明:面對干旱脅迫時黃薇葉內的AsA-GSH循環能夠及時進行活性氧的清除,減輕其細胞的損傷。高溫脅迫下,APX,GR活性和AsA質量摩爾濃度呈上升趨勢,DHAR活性和DHA質量摩爾濃度先上升后下降,MDHAR活性和GSSG質量摩爾濃度先下降后上升,表明高溫脅迫下循環內以APX清除為主,其余的酶則維持著循環內的平衡,保證對活性氧的清除能力;比較各水分組發現各酶活性總體上都在中度干旱組內達到最大值,表明黃薇對高溫脅迫下的干旱也具備一定的抵抗能力。綜上所述,單一高溫或干旱脅迫下,黃薇內的抗氧化防御系統可及時進行響應,維持著植物體的正常生長發育。
但在兩者共同脅迫下,受到輕度脅迫的黃薇仍具有有效的防御能力,而中度和重度脅迫下,活性氧的積累逐漸超出黃薇的承受能力,較單一脅迫造成更大的傷害。研究也發現,在30和36℃時黃薇對環境變化的承受力仍較強,在42℃時如不能及時補充水分則會造成較大的傷害。黃薇在輕度和中度干旱下適應性相對較強,可以適應由高溫情況下短暫缺水情況,在長江以南地區的景觀規劃或生態修復中可擴大其栽培及應用。
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