【摘要】神經浸潤是肝門部膽管癌的一個重要的轉移方式。肝門處由于在解剖上神經、血管、淋巴管的緊密關系，腫瘤可能首先浸潤小血管、淋巴管，在神經纖維周圍形成“衛星”灶，繼而浸潤神經周圍間隙[11]。本試驗結果顯示p27蛋白在無神經浸潤的肝門部膽管癌中的陽性表達率顯著高于已經發生神經浸潤的腺癌(P<0.01)，說明p27蛋白低表達或陰性表達者易發生神經轉移。

　　【關鍵詞】 肝門部膽管癌,p27蛋白,免疫組化

　　Expression of p27 in hilar cholangiocarcinoma and its clinical significance

　　【Abstract】 Objective To discuss the expression of p27 in hilar cholangiocarcinoma and explore its clinical significance.Methods Forty-four hilar cholangiocarcinoma samples and normal bile ducts tissues were collected in General Hospital of PLA from 1996 to 2000.The expression of p27 was determined by immuneohistochemical method.Results The positive rate of p27 were 77.2% in cancerous tissues，but 100% in the control group.Meanwhile，p27 expression had a significant correlation with differentiation of hilar cholangiocarcinoma，lymph node metastases and perineural invasion.The survival curve of the group with low or absent p27 expression was significantly lower than that of the group with high p27 expression.Conclusion Our results suggest that aberrant expression of p27 maybe associated with the incidence and development of hilar cholangiocarcinoma and can be regarded as prognostic markers.

　　【Key words】 hilar cholangiocarcinoma;p27;immunohistochemistry

　　p27蛋白是一個重要抑癌基因，其表達水平降低減低了它對CDK或cyclin/CDK復合物活性的抑制效應，導致CDK的活化效應遞增，使細胞能夠完成細胞周期G1～S期的重要轉換，驅動細胞周期的運行，而使細胞增殖與分裂過快、過多乃至腫瘤形成。目前已在多種腫瘤中予以報道。但是，其在肝門部膽管癌中的表達及其作用，至今國內外報道不多。本試驗通過對44例肝門部膽管癌中p27的表達研究，探討其生物學意義和臨床意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 選取我院1996～2000年經手術切除、術前未行放化療、有明確病理結果及有詳細隨訪資料的肝門部膽管癌標本44例，用中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋。其中男29例，女15例，中位年齡53歲(17～73歲)。按臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ期0例，Ⅳ期29例，其中Ⅳa期27例，Ⅳb期2例。其中高分化腺癌13例，中分化腺癌17例，低分化腺癌9例。對照組標本選取行根治性切除的膽管癌標本的遠端切緣的正常膽管組織。

　　1.2 方法 鼠抗人p27蛋白單克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司，工作濃度為1∶20。抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒購于上海基因有限公司。免疫組化染色采用兩步法(做高溫高壓抗原修復)。用已知p27蛋白陽性的正常扁桃體組織(由北京中杉金橋生物技術有限公司提供)作為陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。

　　1.3 結果判斷標準 參考Michelangelo Fiorentino[1]p27蛋白以細胞核或胞核伴胞質內出現棕黃色顆粒為陽性結果，每張切片選5個高倍視野進行細胞計數，按陽性細胞數占同類細胞的百分比。p27的表達分為，高表達組：陽性細胞≥50%;低表達組：陽性細胞<50%;及陰性表達組，無陽性細胞染色。

　　1.4 統計學方法 采用四格表χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用Log-rank檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。Kaplan-Meier曲線由Stata自動生成。

　　2 結果

　　2.1 p27蛋白在肝門部膽管癌中的表達 p27蛋白染色陽性細胞為細胞核著色。p27蛋白陽性率為77.3%(34/44)，以低表達為主。其中高表達14例(31.8%)，低表達20例(45.5%)，陰性表達10例(22.7%)。而對照組中，p27蛋白陽性率為100%(8/8)，以高表達為主。

　　2.2 p27蛋白表達與膽管癌臨床病理的關系 肝門部膽管癌組織中的p27陽性表達與年齡、腫瘤分化、神經及淋巴的轉移呈顯著相關(P<0.05);p27在高、中分化的肝門部膽管癌中的陽性表達率明顯高于低分化的肝門部膽管癌，兩者差異有非常顯著性(P<0.01)。而p27表達與患者性別、年齡、腫瘤浸潤深度、腫瘤分型[2]、血管轉移、臨床分期等無顯著性相關(見表1)。

　　2.3 p27蛋白與生存隨訪的關系 所有病例皆有完整隨訪資料。p27蛋白高、低及陰性表達組的平均生存時間分別為84個月、72個月與65個月。p27高、低表達及缺失表達組各組生存率經Logrank檢驗，在統計學上差異無顯著性，但在卡-邁二氏曲線上，p27的高表達組生存曲線明顯高于低表達組與缺失組的生存曲線。

　　3 討論

　　p27Kip1是Polyk等[3]于1994年首先克隆出來的，為CDKI家族成員之一，主要作用于G1期，抑制cyclin/CDK復合物的活性，阻止pRb磷酸化，使細胞周期停滯于G1期，抑制細胞增殖。近年研究發現，在多種消化道腫瘤中[4～6]，p27Kip蛋白表達異常與腫瘤的進展和不良預后密切相關。

　　3.1 p27Kip蛋白表達異常原因 在本組病例中，p27蛋白陽性染色定位于腫瘤及正常上皮細胞的胞核內，不同于羅昆侖“p27主要位于腫瘤及正常上皮細胞胞漿”的報道[7]。本組病例中p27蛋白的陽性表達率為77.2%，不同于國內劉岳蘭等[8]關于膽管癌的p27的陽性表達率為40.82%的報道。不同的原因考慮有：(1)取材導致混淆。國內有關膽管癌p27蛋白的研究的取材包括肝內、肝外及肝門部的膽管癌組織，其p27蛋白的陽性率不能代表肝門部膽管癌p27蛋白的陽性率。(2)可能和腫瘤位置的特異性有關。膽管癌不同部位的p27蛋白表達率不同。Michelangelo Fiorentino[1]進行了47例手術切除的肝內膽管癌，肝門部膽管癌22例與周圍肝內膽管癌(peripheral intrahepati cholangiocarcinoma)25例的p27蛋白的檢測，發現肝門部膽管癌的陽性率為59.1%，而外周性肝內膽管癌p27的陽性表達率則為88%。Jarnagin等[9]分析了1992～2002年間經手術切除的標本的細胞周期蛋白p53、cyclin D1、p21、Bcl2、p27、Mdm2和Ki-67的表達情況。其中膽管癌根據來源分為肝內膽管癌、肝門部膽管癌、膽囊癌和遠端膽管癌。結果發現p27的表達隨膽樹的近端向遠端延伸而呈進行性下降，其得出結論：膽管癌表現不同的細胞周期蛋白，這些蛋白的表達取決于腫瘤位置和腫瘤的形態。

　　肝門部膽管癌組織中p27蛋白表達以低表達為主。Motagnolia等[10]認為：一旦受到惡性增殖信號的刺激，p27Kip1的蛋白表達水平下降，一方面由于合成降低，更主要的是通過細胞蛋白翻譯后泛素蛋白酶體降解途徑的速度提高。p27蛋白水平功能的下降減低了它對CDK或cyclin/CDK復合物活性的抑制效應，導致CDK的活化效應遞增，使細胞能夠完成細胞周期G1～S期的重要轉換，驅動細胞周期的運行，而使細胞增殖、分裂過快、過多乃至腫瘤形成。我們推測p27蛋白在肝門部膽管癌中的低表達有可能緣于相同的機制。

　　3.2 p27在肝門部膽管癌進展中的作用 本試驗高、中分化的肝門部膽管癌中的p27陽性表達率明顯高于低分化的肝門部膽管癌，兩者差異有非常顯著性(P<0.01)。這說明在高度惡性的肝門部膽管癌中p27的表達要低于惡性程度較低者，其可作為一個預示惡性程度的指標。

　　p27蛋白在無淋巴結轉移組的表達陽性率明顯高于淋巴結轉移組。以上說明p27蛋白的低表達或丟失可促進細胞外基質的降解和改變細胞間的黏附力，促進腫瘤轉移。

　　以上說明p27蛋白的表達程度與腫瘤的分程演變、分化程度密切相關，也就是說肝門部膽管癌的分化程度越低，腫瘤浸潤范圍越廣，p27蛋白的表達就越低或缺失越高，這提示肝門部膽管癌的病程演變發展與p27蛋白缺失有關。這和國外報道相似[12]。以上充分說明p27是一種抑癌基因蛋白，在肝門部膽管癌的發生發展中起著重要作用。

　　3.3 p27與預后 p27高、低表達及缺失表達組各組生存率經Logrank檢驗，在統計學上沒有顯著性差異，但在卡-邁二氏曲線上，p27的高表達組生存曲線明顯高于低表達組與缺失組的生存曲線，且高表達組的平均生存時間84個月明顯長于低表達組及缺失組的中位生存時間，后者分別為72個月與65個月。當增加樣本量時可望得到各組生存率存在差異性的結論。這說明p27高表達組的預后要好于低表達組及缺失組。

　　綜上所述，p27是一個抑癌基因，可抑制細胞惡性增殖。p27蛋白的減少或缺失與肝門部膽管癌的的發生、進展、轉移及預后有密切關系，可望成為一個預測肝門部膽管癌術后復發的指標。對p27的進一步研究，有助于深入了解肝門部膽管癌的發生、發展機制，并可為判斷預后提供一定的依據，有利于改善預后。