摘要：柑橘(Citrus reticulata Blanco)屬蕓香科下屬植物。性喜溫暖濕潤氣候，耐寒性較柚、酸橙、甜橙稍強。蕓香科柑橘亞科分布在北緯16°~37°之間。是熱帶、亞熱帶常綠果樹(除枳以外)，用作經濟栽培的有3個屬：枳屬、柑橘屬和金柑屬。中國和世界其他國家栽培的柑橘主要是柑橘屬。

　　關鍵詞：柑橘,科學種植,農業科技論文

　　柑橘的組成由：根、莖、葉、花和果實組成。小喬木。單身復葉，翼葉通常狹窄，或僅有痕跡，葉片披針形，橢圓形或闊卵形，大小變異較大，頂端常有凹口，中脈由基部至凹口附近成叉狀分枝，葉緣至少上半段通常有鈍或圓裂齒，很少全緣。花單生或2-3朵簇生;花萼不規則5-3淺裂;花瓣通常長1.5厘米以內;雄蕊20-25枚，花柱細長，柱頭頭狀。葉柑橘的葉片為常綠性的單生復葉，由葉身、葉翼組成。葉翼著生在葉柄上。柑橘種類品種不同，葉的大小不等，形狀各異。[5] 根由主根、側根、須根及須根端著生極短的根毛構成的群體，統稱為根系。壓條或繁殖的植株，無主根。樹干與根交界處，叫根頸。[5] 枝干柑橘枝干由主干、主枝、側枝組成。

　　果形種，通常扁圓形至近圓球形，果皮甚薄而光滑，或厚而粗糙，淡黃色，朱紅色或深紅色，甚易或稍易剝離，橘絡甚多或較少，呈網狀，易分離，通常柔嫩，中心柱大而常空，稀充實，瓢囊7-14瓣，稀較多，囊壁薄或略厚，柔嫩或頗韌，汁胞通常紡錘形，短而膨大，稀細長，果肉酸或甜，或有苦味，或另有特異氣味;種子或多或少數，稀無籽，通常卵形，頂部狹尖，基部渾圓，子葉深綠、淡綠或間有近于乳白色，合點紫色，多胚，少有單胚。花期4-5月，果期10-12月。[6]

　　研究背景

　　柑橘是世界第一大水果。目前對柑橘生產危害最為嚴重的病害有黃龍病、潰瘍病、衰退病等(Gmitter et al., 2012)采用藥劑防治雖然也有一定的效果，但勢必造成環境污染，而且易導致食品安全問題;持續用藥，病原物可能會產抗藥性(Behlau et al., 2011)，從而會加大防治難度。噴施農藥雖然有一定的功效，但長期噴施容易帶來3R (Residue, Resistance, Resurgence)問題。因此抗病育種成為柑橘育種的重要目標之一。如果成功分離和克隆R基因，直接在基因水平上開展基因工程育種，就能有效加快抗病育種進程。植物抗病基因(Resistance gene,R基因)的克隆與分析已經成為植物抗病育種的研究熱點。1992年玉米抗圓斑病基因Hml被克隆，這是世界上第一個被克隆的R基因(Johal and Briggs, 1992)。之后有學者發現R基因的序列同源性較高，編碼的蛋白質具有相似的結構域(Ellis et al., 1995; Song et al., 1995; Lawrence et al., 1995; Grant et al., 1995; Zhou et al., 1995; Hammond-Kosack and Kanyuka, 2007)。Kanazin等(1996)利用R基因產物的保守結構域設計引物對植物DNA進行擴增，發現擴增產物與R基因同源性較高，將其稱之為resistance gene analog (RGA)，中譯為抗病基因同源序列。也有學者將稱之為resi- stance gene homologue (RGH, Brotman et al., 2002)，resistance gene candidate (RGC, Shen et al., 1998)，resistance gene-like sequence (RGL, Vicente and King, 2001)，分別中譯為抗病基因類似物、抗病候選基因、類抗病基因序列。其中抗病基因同源序列(RGA)被廣泛使用。RGA是一類結構上與R基因類似的序列。有的RGA與R基因緊密連鎖，有的RGA本身即是R基因。根據RGA的上述特點，RGA在以下幾個方面得到了應用：作為一種分子標記，用于標記抗病基因(丁國華, 2004)，構建遺傳圖譜(Bakker et al., 2011; Niu et al., 2011)、分子標記輔助育種(Silva et al., 2012)以及種質資源分析(肖天霞, 2006);將RGA作為探針，篩選基因組文庫克隆抗病基因(Feuilet et al., 1997)。目前克隆RGA有兩種方法：PCR擴增得到RGA，數據庫檢索法預測RGA (張禮鳳等, 2009; 任鄄勝, 2008; 尚世界, 2009; Rossi et al., 2003)。柑橘RGA研究亦有所開展。本文將對柑橘RGA的研究進展作一綜述，并對柑橘RGA的應用進行了探討。

　　1、PCR擴增得到柑橘RGA

　　目前，獲得柑橘RGA多采用PCR擴增的方法。

　　PCR擴增的方法有兩種類型：一種是根據R基因編碼的蛋白質保守結構域設計簡并引物，對基因組DNA進行擴增，得到RGA;另一種是根據R基因保守序列設計引物，對cDNA進行擴增，得到有表達信息的RGA。對基因組DNA進行擴增獲得RGA是比較常用的方法。Deng等(2000)根據NBS類抗病基因產物的保守結構域設計6條簡并引物，構建4個引物組合，對柑桔屬和枳屬的屬間雜種“USDA17-47”的基因組DNA進行擴增，擴增產物的序列分析表明，22條序列屬于NBS-LRR類R基因超家族，并開發了與柑橘衰退病和根結線蟲有關的CAPS標記。Deng等(2003)以“USDA17-47”為試材，根據水稻白葉枯病抗性基因Xa21和番茄青枯病抗性基因Pto編碼的氨基酸保守結構域設計2條簡并引物，最終克隆獲得29條柑橘蛋白激酶類RGA，且明確了各序列以1~3個拷貝形式存在基因組中，利用引物步行法獲得2個序列的全長，具備Xa21蛋白的全部特征。安然(2010)根據細菌斑點病基因prf和擬南芥霜霉病基因RPM1編碼的蛋白質保守結構域NBS-LRR設計2條簡并引物，對構櫞、貞橙、三葉、椮橙、宜昌橙25-86、冰糖橙6個柑橘品種的基因組DNA進行擴增，獲得了9個RGA。對cDNA進行擴增獲得RGA的研究較少。諶謀華(2003)根據已知抗病設計了8條引物，組成15對引物，對枳殼、九里香、黃皮、國慶1號的基因組DNA及枳殼、九里香、國慶1號的cDNA進行擴增，獲得了25個RGA，并以其中的RGAn-17-2作探針，對柑橘基因組DNA進行RFLP分析，RGAn-17-2在枳殼、九里香、黃皮、國慶1號中都有若干同源片段。黃代青等(2004)提取琯溪蜜柚花柱的總RNA，通過逆轉錄合成其cDNA，根據R基因編碼的蛋白質NBS保守結構域設計2條簡并引物，對cDNA進行擴增，獲得大小約為500 bp的PCR產物，對連接產物進行酶切歸類，篩選得到不同類別的克隆12個，并進行了測序。通過序列同源比較分析發現，其中有10個片段屬于NBS-LRR 類RGA，與已知植物R基因相應區段的氨基酸序列的同源性為11.5%~47.1%。

　　目前,幾乎所有已知柑橘RGA都是通過PCR擴增的方法獲得。這種方法對沒有全基因序列且基因組龐大的物種來說比較適宜，但不足之處是不能覆蓋全基因組的RGAs。急需采用新的方法滿足柑橘RGA研究的需要。

　　2、數據庫檢索法預測柑橘RGA

　　隨著基因組學及生物信息學的發展，許多植物的EST序列相繼公布，并且一些物種基因組測序已經完成，發展了數據庫檢索(data mining)的方法，即從EST或基因組測序中利用生物信息學手段尋找RGAs，可以獲得該物種全基因組的表達RGA。該方法簡單快速，信息量大，是預測R基因的有效方法，已在大豆(張禮鳳等, 2009)、甘蔗(Rossi et al., 2003)、小麥(Dilbirligi and Gill, 2003)、玉米(Xiao et al., 2006)、水稻(肖天霞, 2006; Wang et al., 2005)等作物上成功應用。目前在柑橘上尚未見利用數據庫檢索法獲得RGA的報道。柑橘的基因組較小，基因組測序已經完成。若用數據庫檢索的方法在全基因組水平上克隆柑橘RGAs將提供一個通過RGA途徑高效克隆柑橘R基因的技術平臺，會大大加快柑橘抗病基因研究的進程。

　　3、柑橘RGA的應用

　　Yang等(2001)根據NBS保守結構域設計了一對簡并引物，對枳殼BAC文庫進行擴增和酶切，獲得了一個1.2 mol的重疊群，其中包含了柑橘衰退病抗性基因座。這個基因座的幾個預測抗性基因與水稻Xa21基因，番茄Cf-2基因以及擬南芥RPS2基因相似，可用于標記抗病基因。向旭等(2005)對從柑桔與枳屬間雜種的基因組DNA 所獲得的RLK-RGA，設計簡并引物，對柑桔抗潰瘍病材料和感病材料進行分析，獲得了一個與柑 橘 潰 瘍 病 相 關 的 特 異 性 更 強 的 抗 性 標 記 -19h16/Dde1標記位點，可用于分子標記輔助育種。Songwattana (2010)利用12對NBS-LRR RGA序列(Deng et al., 2000)作引物結合限制性酶切對泰國萊檬雜種m33以及父母本Pan and Nam Hom的抗性基因進行了篩選，結果表明標記Pt9/Alu1、Pt14/ Bfa1、16R1-19/Tru1I與M33和Nam Hom lime的抗性基因緊密連鎖;Pt9和16R1-19的蛋白質分析表明其屬于non-TIR-NBS-LRR亞家族，Pt14屬于TIR- NBS-LRR亞家族。向旭等(2009)利用3個與柑橘根結線蟲連鎖的NBS-LRR RGA序列(Deng et al., 2000)作標記，對柑屬和枳屬的屬間雜種“USDA17-47”進行擴增并酶切，獲得了一個柑橘根結線蟲抗性標記。Gulsen等(2010)利用2個RGA標記(Deng et al.,2000)結合SRAP、SSR、ISSR、POGP、RGA及 RAPD標記建立了一個柑橘連鎖圖譜。上述柑橘RGA的應用多集中于抗性標記方面。利用柑橘RGA克隆抗病基因尚未見報道。

　　4、展望

　　基于RGA克隆抗病基因已經得到共識。但利用RGA進行抗病基因克隆也存在一些問題：抗病基因編碼的蛋白質由于密碼子的簡并性，根據抗病基因產物的蛋白質保守結構域設計的簡并引物特異性不足;同源序列同源性不一，也使得引物設計有偏差;抗病基因多成簇存在，克隆得到的RGA不一定是目的片段。已有學者對其進行改進，如用高分辨率的PAGE膠代替瓊脂糖電泳，提高擴增產物的分辨效率(Rivkin et al., 1999)。也可直接將RGA轉入柑橘植株，觀察轉基因植株的表現，進而分析RGA的功能，或者根據RGA序列設計特異性引物，轉換為CAPS標記，可用于分子標記輔助育種。與水稻、小麥等作物相比，柑橘RGA的研究較為薄弱，對其利用也研究較少。柑橘基因組測序的完成為在全基因組水平上大規模挖掘RGA提供了新契機。在后基因組時代，柑橘RGA將會在柑橘抗病研究中發揮更大的作用。