摘要：在簡述固定化酶及其特性的基礎上，對固定化酶在食品工業(食品加工貯藏、食品添加劑生產、生物活性肽制備和食品檢測)中的應用研究進行綜述.指出：將固定化酶應用于食品工業中，既可提高酶的穩定性和生產效率、實現酶的重復利用、增加目標物的工業產量、降低生產成本，還可保留產品的原有風味、增加其功能性，同時也可提高生物傳感器的檢測靈敏度、縮短反應時間及簡化操作步驟.未來可在尋求新的固定化技術和固定化載體、優化固定化預分離技術、制備能夠進行多酶反應的新型固定化酶等方面開展深入研究，以進一步推進固定化酶在食品工業中的應用.
關鍵詞：固定化酶;食品工業;加工貯藏;食品添加劑;生物活性肽;食品檢測
0 引言
早在80年前，一些專家發現吸附在骨炭粉上的酶具有生物活性，啟發了業界學者對固定化酶的探索.1953年，N.Grubhofer等[1]將聚苯乙烯樹脂重氮化后作為載體與胃蛋白酶、淀粉酶、羧肽酶、核糖核酸酶共價結合，制成了最早的固定化酶.1969年，日本的千畑一郎將固定化的氨基酰化酶(該固定化酶的生產成本比游離酶低60%)成功應用于D-氨基酸、L-氨基酸的光學分析，開拓了國際上利用固定化酶進行連續工業化生產的道路，這也是酶應用歷史上的一次偉大變革[2].1970年，中國科學院生物化學研究所和中國科學院微生物所開始研究固定化酶，揭開了我國探索固定化酶的序幕.隨后，國內多家科研單位開始研究固定化酶，發展勢頭銳不可擋.本文在簡述固定化酶及其特性的基礎上，綜述了固定化酶在食品加工貯藏(乳制品加工、水產品加工、油脂改性、啤酒儲存)、食品添加劑(高果糖漿、低聚果糖、L-蘋果酸、L-天門冬氨酸、阿斯巴甜)生產、生物活性肽(酪蛋白磷酸肽(CPP)、高F值寡肽)制備和食品檢測中的應用現狀，并指出了未來的研究方向，以期為固定化酶在食品工業中的廣泛應用提供參考和新思路.
1 固定化酶
采用人工措施將酶從生物體內提取出來并固定到相應的載體上，即可制得在一定空間內具有催化效應的固定化酶.固定化酶主要有線條、顆粒、薄膜、酶管等形狀，其中，顆粒固定化酶的應用最為廣泛，它和線條固定化酶主要用于發酵工業生產，可大大提高發酵的反應效率;薄膜固定化酶主要用于酶電極;酶管固定化酶的機械強度較大，主要用于食品檢測[3-5].固定化酶除了具有酶的一般催化特性(如底物特異性、反應溫和、高效等)[6]外，還具有如下優點：可提高對溫度、pH值的適應性，以及對蛋白酶、抑制劑的抗性[7];可通過簡單的方法回收再利用，且酶活力損耗少;后續與產物、底物的分離純化較容易[8];可批量操作并具有連續性，適用于連續化、自動化的工業生產[9].然而，固定化酶在固定化處理、分離等過程中具有如下缺點：工業化生產投資較大;固定化預分離時酶活力的損失較大，其中胞內酶尤為明顯;不易進行多酶反應，輔助因子在某些酶的反應中起關鍵作用;小分子底物易與固定化酶反應，大分子底物與其反應概率較低，且只對水溶性底物具有催化作用[10].
固定化酶的固定方法主要包括包埋法、吸附法、共價法和交聯法[11-18].其中，包埋法不涉及酶的構象和酶分子的化學變化，合成簡單，但存在擴散限制、傳質受阻等問題，不適合催化大分子底物[17];吸附法工藝簡單，條件溫和，載體選擇范圍廣且可再生，主要通過一些較弱的相互作用力(如氫鍵、范德華力、親疏水作用、靜電作用等)實現酶的固定化;共價法和交聯法屬于化學固定方法，所形成的化學鍵由于能量較高而難以斷裂，故這兩種固定方法不可逆
近年來，固定化酶被廣泛應用于食品、醫藥、化工等行業[19]，因其具有節約資源和能源、減少或防治污染的生態環境效應而符合當代可持續發展的戰略要求.王歡等[20]利用氨基化樹枝狀介孔SiO2固定葡萄糖氧化酶，用于檢測血清和飲料中的葡萄糖，該固定化酶重復使用36次以上仍具有80%的相對酶活力.該方法操作方便、準確度高，提高了酶的pH穩定性和熱穩定性，降低了檢測成本.N.Marjan等[21]使用多醛交聯劑制備了磁性納米粒子固定果膠酶，提高了果膠酶的回收率和酶活力.M.M.D.Júlia等[22]利用固定化殼聚糖酶生產殼寡糖，與β-葡萄糖苷酶、纖維素酶相比，該固定化酶表現出較高的穩定性，在水解6個周期后，仍可保持70%的初始酶活力.
2 固定化酶在食品加工貯藏中的應用
2.1 乳制品加工
乳制品是人們日常所需蛋白質等的重要來源，其對固定化酶的要求較高，因而，如何利用固定化酶生產高質量的乳制品是研究人員一直關注的重點.1998年底，中國食品添加劑標準化委員會將乳糖酶列為食品添加劑的新品種，使乳糖酶在乳制品工業中的應用更為廣泛.固定化乳糖酶可分解乳糖、制造干酪，主要應用于液體乳制品(如低乳糖牛奶)、冷凍乳制品(如冰激凌、雪糕、速凍酸乳酪)、糖的替代添加劑(如低聚半乳糖)等方面.牛奶中的乳糖含量一般為4.3%～4.5%，乳糖酶可將其分解為葡萄糖和半乳糖，避免乳糖不耐癥患者產生腹脹、腹瀉等不良反應.固定化乳糖酶能夠連續水解乳制品中的乳糖，大大提高乳糖的分解效率[23].李燕等[24]采用聚丙烯酰胺凝膠包埋米曲霉制備了固定化乳糖酶，該固定化酶的熱穩定性明顯增強且適宜的溫度范圍增大，酶活力損失較少，機械強度也有所增大.使用該固定化酶水解牛奶，不但能夠保持牛奶原有的風味，還能增加甜度，減少其他糖類的添加量[25].將固定化乳糖酶應用于冰淇淋類產品的加工中，既可提升冰淇淋類產品的口感和甜度，還可彌補乳糖在低溫時易結晶的缺點[26].
2.2 水產品加工
酶工程是對水產品加工影響最大的一種生物技術，固定化酶不僅可改善水產品的品質，還可提升水產品的營養價值.海參是一種營養價值較高的海鮮產品，由于放養密度過大、日常管理不科學、池底環境含氮量較高、人工復合餌料研究滯后等問題，海參的多種并發癥日益凸現.在餌料中適量添加益生菌和有助于海參消化的酶制劑是解決上述問題的關鍵.李向陽等[27]采用包埋法，將真菌α-淀粉酶固定化在環保、無毒、廉價的海藻酸鈉上制成海參餌料添加劑，提高了海參腸道內淀粉的消化利用率，減少了代謝產物的排出量.固定化酶也可使一些低附加值水產品副產物得到更為合理的利用.羅非魚是較為常見的淡水養殖魚類，在水產加工方面主要用于魚片的生產，其副產物一般用作飼料或肥料，利用率很低.瞿葉輝[28]采用吸附法制備殼聚糖埃洛石 (CS/HNTs) 復合微球并用于固定木瓜蛋白酶，該固定化酶儲存性更好，穩定性更高，可大大提高木瓜蛋白酶的利用價值.利用該固定化酶從羅非魚副產物中提取的抗氧化活性多肽，可作為添加劑應用于食品、化妝品等行業.
2.3 油脂改性
脂肪酶是一種能夠顯著提高油脂催化效率的綠色生物催化劑，在油脂工業中應用廣泛，可通過水解、酯交換、酯轉移等反應達到油脂改性的目的[29]，例如，1，3-特異性脂肪酶可進行酶促酯交換反應，將棕櫚油催化改性為制作巧克力的代可可酯[30].然而，脂肪酶易受水、溫度、 pH值、酶液濃度、底物濃度、酶的激活劑或抑制劑等因素影響，導致酶失活、目標物產率降低[31].為了解決上述問題，R.Rao等[32]使用固定化的脂肪酶M60催化鱈魚肝油，獲得了富含w\|6或w\|3系列多不飽和脂肪酸等脂類物質;J.B.Lyu等[33]通過共價連接方式，將用醛標記的枯草芽孢桿菌脂肪酶A固定在Fe3O4單分散磁鐵礦微球上，重復反應10次后，該固定化脂肪酶的酶活力仍能保持在90%，同時，酶的熱穩定性和溶解度大大提高，酶凝聚在一起的可能性也被降低.
2.4 啤酒儲藏
在儲藏過程中，啤酒中的多肽和多酚成分會發生聚合反應，造成啤酒出現渾濁現象.木瓜蛋白酶可以水解啤酒中的多肽和蛋白質，但由于水解度的大小直接影響啤酒的泡沫穩定性，所以需要控制水解程度[34].溫燕梅等[35]采用吸附-交聯法使胰蛋白酶先吸附于磁性膠體粒子表面，然后利用戊二醛雙功能試劑交聯形成固定化酶，該固定化酶對預防啤酒渾濁有明顯的效果.趙炳超等[36]以戊二醛為交聯劑、介孔分子篩MCM-48作載體固定木瓜蛋白酶，所得固定化酶的熱穩定性顯著提高，pH穩定性和儲藏穩定性也有明顯改善.經固定化酶處理的啤酒，既可保持儲藏過程中良好的澄清度，也可保證風味上與傳統啤酒無明顯差異.
3 固定化酶在食品添加劑生產中的應用
高果糖漿、低聚果糖、L-蘋果酸等是常用的食品添加劑，利用性能穩定的固定化酶生產這些食品添加劑，具有產量高、成本低等優點.
3.1 高果糖漿的生產
固定化葡萄糖異構酶是目前全球產量最高、應用范圍最廣的一種固定化酶，一般是將其固定在菌體上，常用的固定方法是熱處理法，溫度需達到60～65 ℃，熱處理時間持續15 min.以淀粉為原料生產高果糖漿的關鍵酶主要有以下3種：α-淀粉酶，又稱液化酶，主要起到淀粉液化的作用;葡萄糖淀粉酶，其水解產物為β-葡萄糖;葡萄糖異構酶，可將葡萄糖異構為果糖，是催化淀粉最關鍵的酶.早在1973年，研究者就使用固定化的葡萄糖異構酶催化淀粉生產高果糖漿.采用此方法獲得的高果糖漿，果糖含量高達55%，且價格比蔗糖低10%～20%，經濟效益較高[37].使用高果糖漿替代蔗糖是固定化酶應用最成功的工業案例，500 t固定化的葡萄糖可生產約1×107 t高果糖漿[38].但該工藝在我國發展比較緩慢，目前只應用于高果糖漿的小規模生產[39]，因此，急需尋找新型固定化載體，制備可以高產量生產高果糖漿的固定化葡萄糖異構酶，以降低生產成本，提高經濟效益.
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