〔摘要〕 目的 觀察不同濃度的枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide， LBP)對(duì)體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal capillary endothelial cells， HRCEC)增殖及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)表達(dá)的影響。方法 獲取人眼球摘除術(shù)后的HRCEC，予以體外培養(yǎng)，選取最佳狀態(tài)的3～4代細(xì)胞;CCK8法檢測(cè)在不同濃度LBP體外高糖環(huán)境下分別作用12、24、36 h后HRCEC的增殖情況;Western blot法檢測(cè)各組HRCEC的VEGF表達(dá)情況。結(jié)果 同一時(shí)間組間比較，高糖組HRCEC活性及VEGF的表達(dá)量均高于低糖組(P<0.05);不同濃度LBP實(shí)驗(yàn)組HRCEC活性及VEGF表達(dá)量均明顯低于高糖組(P<0.05)，80 μg/mL LBP組HRCEC活性及VEGF表達(dá)低于20 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組與40 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組(P<0.05);各實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)36 h時(shí)， HRCEC活性及VEGF表達(dá)低于干預(yù)12 h與24 h(P<0.05)。結(jié)論 LBP能抑制高糖環(huán)境下HRCEC的增殖并下調(diào)VEGF的表達(dá)，并與LBP濃度和作用時(shí)間正相關(guān)。

　　〔關(guān)鍵詞〕 枸杞多糖;人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞;血管內(nèi)皮生長因子;高糖;新生血管

　　糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy， DR)發(fā)病率逐漸升高，世界范圍內(nèi)的糖尿病患者中，DR患病率約34%[1]，DR早期癥狀隱匿，極易導(dǎo)致失明[2]。DR發(fā)生的主要原因是視網(wǎng)膜缺血缺氧，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，VEGF高表達(dá)，最終視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization， RNV)形成，DR的主要并發(fā)癥是視網(wǎng)膜出血與黃斑水腫(diabetic macular edema， DME)。玻璃體腔注射抗VEGF藥物雖然是DR并發(fā)黃斑水腫的一線治療方法[3]，但抗VEGF藥物(雷珠單抗、貝伐單抗、阿柏西普、康柏西普等)價(jià)格昂貴、作用時(shí)間短[4]。尋求價(jià)格低廉、安全有效的抗VEGF藥物成為目前DR研究的熱點(diǎn)。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide， LBP)是一種天然水溶性多糖，藥理作用廣泛。LBP可以降低DM小鼠的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及血管新生[5]，LBP還可以抑制VEGF、Ang及其受體在DM小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)，具有治療DR的作用。既往雖然較多關(guān)于LBP在糖尿病、血管內(nèi)皮細(xì)胞等方面的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal capillary endothelial cells， HRCEC)的相關(guān)研究，本文基于LBP對(duì)小鼠糖尿病VEGF抑制作用的基礎(chǔ)上，研究了LBP對(duì)高糖環(huán)境下HRCEC及VEGF的影響，期望為研發(fā)防治DR新藥物提供基礎(chǔ)研究。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　1.1.1 主要試劑 胎牛血清(Gibco公司，貨號(hào)04-001-1ACS);LBP(陜西康盛生物技術(shù)有限公司，KS118，純度35%);兔抗人VEGF 抗體(博奧森公司，貨號(hào)bs-0279R);β-actin(Mouse)、HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG(美國proteintech公司，貨號(hào)依次為：66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2);高糖培養(yǎng)基(SIGMA公司，貨號(hào)D5796);蛋白預(yù)染Marker(Thermo公司);SuperECL Plus超敏發(fā)光液(美國Advansta公司，貨號(hào)K-12045-D50);胰酶消化液、RIPA裂解液(中國上海碧云天生物有限公司，貨號(hào)C0201、P0013B);顯影液、定影液(中國上海佳信公司，BW-61、BW-62);蛋白裂解液(中國上海碧云天公司，貨號(hào)P0013B);TEMED(中國上海阿拉丁公司，T105497);SDS(中國大連美倫公司，貨號(hào)MB2479);第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體(Abcam公司)。

　　1.1.2 LBP溶液的配制 LBP母液配置：稱取35%含量LBP 10 mg，加入10 mL DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋，搖勻、溶解，500 r/min離心5 min，雙層0.22 μm微孔濾膜過濾細(xì)菌及沉淀，并密封分裝，4 ℃保存。此時(shí)母液配置完成，含量為1 mg/mL。配置實(shí)驗(yàn)LBP濃度，移取母液200 μL置于15 mL離心管中，加入DMEM高糖培養(yǎng)基至10 mL，反復(fù)搖勻，配置成20 ?滋g/mL LBP，做好標(biāo)記，置于4 ℃冰箱保存。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 HRCEC的培養(yǎng) 在南華大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)室選取角膜移植手術(shù)后余下的眼球，慶大霉素注射液浸泡30 min，分離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，常溫下2%胰蛋白酶消化，過濾，加入20%小牛血清培養(yǎng)液停止消化，1 200 r/min離心8 min，去除上清液，在離心管內(nèi)加入10% Gibico FBS+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，接種于含有10% Gibico FBS+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，再置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿底部約80%時(shí)進(jìn)行傳代。

　　1.2.2 HRCEC鑒定 (1)細(xì)胞爬片;(2)固定：PBST洗涕，加入4%PFA(多聚甲醛)，4 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min固定;(3)按照Western blot實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行破膜封閉、一抗孵育、二抗孵育;(4)包埋：抽取已二抗孵育好的細(xì)胞爬片，PBST緩沖液清洗，滴取1滴Fluoromount-G后蓋玻片再蓋上;(5)陽性染色鏡檢示：經(jīng)過山羊抗小鼠IgG二抗橙紅色DyLight594熒光標(biāo)記。顯微鏡下觀察并采集圖像。

　　1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長的細(xì)胞進(jìn)行分組：(1)AL組：低糖對(duì)照組(低糖+細(xì)胞);(2)AG組：高糖對(duì)照組(高糖+細(xì)胞);(3)A1組：20 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組;(4)A2組：40 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組;(5)A3組：80 μg/mL LBP實(shí)驗(yàn)組。其中低糖濃度為1 g/L，高糖濃度為4.5 g/L;實(shí)驗(yàn)組為不同濃度LBP+高糖培養(yǎng)基+細(xì)胞。

　　1.2.4 CCK8法行細(xì)胞增殖活性的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL。各組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)貼壁，每孔加入10 μL/孔的CCK8，用完全培養(yǎng)基配置CCK8溶液，去除含藥培養(yǎng)基每孔加入100 μL含有CCK8的培養(yǎng)基。37 ℃，5% CO2繼續(xù)孵育4 h后于Bio-Tek酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(OD)值，測(cè)定各組HRCEC的增殖活性。

　　增殖抑制率=(高糖對(duì)照組OD值-藥物干預(yù)組OD值)/高糖對(duì)照組OD值×100%

　　1.2.5 Western blot 蛋白檢測(cè) (1)PBS洗滌細(xì)胞，3 000 r/min離心2 min，加入120 μL RIPA裂解液，超聲破碎1.5 min;冰上裂解;4 ℃，12 000 r/min離心15 min;取上清液。按照BCA法，測(cè)定550nm之間波長的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。(2)樣品準(zhǔn)備：取80 μL蛋白上清，加入20 μL 5*loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。(3)電泳：點(diǎn)入marker 2 μL，其它按照分組順序每孔上樣15 μL已變性蛋白。恒定電壓75 V，130 min。(4)轉(zhuǎn)膜：分別切膠VEGF(24kD)，β-actin(42kD);300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜，VEGF約39 min，β-actin 約60 min。(5)封閉：用1*PBST配制5%脫脂奶粉，室溫封閉60 min，4 ℃過夜，次日室溫放置30 min。(6)一抗孵育：加入一抗(Rabbit Anti-VEGF antibody (bs-0279R)，1∶1 000;Mouse anti-β-actin antibody(66009-1-Ig)1∶5 000，室溫孵育90 min;1*PBST洗3次，每次15min。(7)二抗孵育：加入二抗(HRPgoatanti-mouse IgG，SA00001-1，1∶5 000;HRPgoat anti-rabbit IgG，SA00001-2，1∶6 000)溫孵育90 min后1*PBST洗3次，每次10 min。(8)顯色/曝光：化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence， ECL)顯色曝光，顯影沖洗，Image lab軟件分析灰度值。

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