摘要 生物組織中的細胞處于充滿細胞外基質(ECM)的三維環境中，ECM不僅為細胞提供物理支架，還產生有關腫瘤細胞生物學功能的生化或生物物理信號。在許多模擬體內細胞—基質相互作用的方法中，利用水凝膠進行細胞培養已經揭示了一些基質機械性質協調細胞行為的基本現象。肝細胞癌(HCC)是最常見的原發性惡性腫瘤之一，其發展與組織硬度密切相關：正常的肝臟組織在受到刺激損傷后發生炎癥，隨后轉化為肝纖維化，然后惡化為肝硬化，最終發展為肝細胞癌。隨著這個過程的發展，肝組織的硬度不斷增加，而增加的基質硬度又促進肝癌細胞的增殖、遷移、上皮細胞—間充質轉化和耐藥性，促進了HCC的發展。表明了基質機械性質在促進肝癌惡化進程中的重要作用。本文綜述了細胞外基質的機械性質對肝癌發展的影響，并展望了基于力學微環境揭示肝癌病理機理的重要意義。
關 鍵 詞 細胞外基質;肝細胞癌;硬度;水凝膠;腫瘤微環境
0 引言
生物組織中的細胞處于充滿細胞外基質(ECM)的三維環境中，以ECM作為支架實現了細胞與細胞之間、細胞與環境之間的物質和能量交換，通過信號轉導系統影響細胞的形態、代謝、功能、遷移、增殖和分化等行為。除生物化學因子外，ECM為細胞的生存和功能提供了適宜的機械力學環境，包括基底剛度、流體靜壓、剪切應力、應變、壓力和張力等物理信號。這些力學因素在調控細胞的正常生理功能、疾病的發生中同樣起著重要作用。例如，在胚胎發育階段，細胞外基質的硬度參與了胚胎干細胞向不同類型細胞的分化過程;同一器官的健康狀態和疾病狀態之間表現出顯著的機械性能差異[1]。在某些癌變組織中，由于細胞的無限增殖，血管的高滲透性，淋巴引流不足以及細胞外基質沉積的增加，導致實體腫瘤組織與未轉化的正常組織相比硬度顯著增加。值得注意的是，細胞機械微環境的改變又反作用于細胞本身，進一步調控細胞增殖、侵襲、凋亡、抗藥性、血管生成、代謝和促進生長的信號通路，從而導致腫瘤惡性化進程[2-5]。越來越多的證據表明，物理機械環境是調控腫瘤發展的關鍵因素。
肝細胞癌(HCC)是最常見的原發性惡性腫瘤之一，是一個連續的、多步驟進展的癌變病理過程，且絕大多數發生在肝纖維化和肝硬化的基礎上，復發頻率高且預后差。目前，通過醫學影像對肝臟硬度的檢測已經成為診斷癌前病變與 HCC的重要手段。肝纖維化、硬化結節病變過程導致肝細胞生長的微環境改變，包括生化因素和生物力學因素[6]，而這些改變反過來促進HCC的發展，提高了肝癌細胞的增殖活性和侵襲性。2011年Schrader 等[7]發現增加基質硬度可促進肝癌細胞增殖和對化療的耐藥性，而軟基質環境可誘導HCC中可逆性細胞休眠和干細胞特征。2019年Gao等[6]研究發現機械適應賦予肝癌細胞運動性和對索拉非尼的耐藥性增加，且肝硬化硬度影響肌動蛋白的組織和肝癌細胞遷移，增加患者的臨床預后風險。此外，機械力學微環境對肝細胞的癌變、形態、增殖、代謝以及遷移等細胞活性有著重要作用。基于此，本文總結了肝硬化與肝癌的發展過程、細胞外基質的作用及體外模擬，以及細胞外基質硬度對肝癌發展的影響，并展望了基于力學微環境揭示肝癌病理機理的重要意義。
1 肝硬化與肝癌的發展過程
肝臟負責營養素的代謝、合成、儲存和再分配，并且在體內平衡中起著核心作用。肝細胞癌形式的原發性肝癌是全球第五大常見的癌癥，是男性中第五常見的惡性腫瘤，在女性最常見的惡性腫瘤中排第九[8]，并且是第二大最常見的癌癥死亡原因[9]，主要治療手段是切除手術和移植手術[10]。我國是原發性肝細胞肝癌的高發國家，HCC是肝癌最主要的病理類型，占90%以上，具有侵襲性、轉移及復發率高等特點[11]。HCC是一個連續的、多步驟進展的癌變病理過程，且絕大多數發生在肝硬化的基礎上，如圖1[12]所示正常的肝臟組織在病毒、酒精、活性氧等刺激損傷后發生炎癥，隨后轉化為肝纖維化(Stage 1)，然后惡化為肝硬化(Stage 2)，最終發展為肝細胞癌(Stage 3)(HCV：丙型肝炎病毒; HBV：乙型肝炎病毒;NAFLD：非酒精性脂肪肝疾病;NASH：非酒精性脂肪性肝炎)。
1.1 正常肝到肝纖維化(Stage 1)
毒素、病毒、膽汁淤積、應力、活性氧、自身免疫性損傷、代謝產物等刺激可引起慢性肝臟疾病，當這些刺激對肝臟重復損傷或長期持續時，肝再生就會失敗，這將導致膠原ECM(主要是I型膠原)的過度積累——稱為“肝纖維化”。這些損傷通過誘導細胞因子/生長因子和其他激活纖維化的下游效應子——主要是活化的肝星狀細胞(HSC)和成肌纖維細胞(MF)以及程度較低的活化的竇狀內皮細胞，從而驅動纖維生成(增強的ECM合成)[13-16]，導致ECM成分如膠原的沉積增加。同時HSC/MF和各種其他細胞會增加金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP-1)的合成，降低基質金屬蛋白酶(MMP)的含量和活性。MMPs在錯誤的位置或時間發生的失活和活性降低也會促進細胞遷移和增殖，可驅動繼發性纖維化反應，最終形成肝纖維化[17]。因此，肝纖維化是所有慢性肝病(CLD)的常見結局[18]。纖維化伴隨著免疫細胞組成的改變和血管生成的改變，最終導致嚴重的結構改變，損害器官功能[19]。
1.2 纖維化發展為肝硬化(Stage2)
肝纖維化的終末期不可逆轉的結果是大量的發病和死亡，其特征是形成被纖維化隔膜包圍并分隔的實質的再生結節。全世界有1.7億患者患有慢性肝病，其中25%至30%會發展為明顯的纖維化并最終發展為肝硬化[18]。如果損傷因素長期不能去除，纖維化的過程長期持續就會發展成肝硬化。在慢性肝病末期觀察到的一組形態學改變，以肝實質的血管結構紊亂為特征，肝臟逐漸變形、變硬而被稱為“肝硬化”[20]。肝硬化肝細胞的特征在于波形蛋白和I型膠原蛋白的表達增加，表明上皮-間充質轉化(EMT)的開始，即上皮細胞失去表型特征并獲得間充質細胞特征的過程[21]。此外肝硬化伴隨肝細胞增殖減少，表明肝臟的再生能力用盡，并導致纖維組織增加和肝細胞破壞，最終可能導致癌性結節的發展[22]。
1.3 肝細胞癌合并肝硬化(Stage3)
肝硬化患者的5年累積肝細胞肝癌發生率為 5%～30%[23]，但由于大多數肝硬化患者無癥狀，因此很難診斷出早期肝癌[24]，所以有肝癥狀和肝癌的患者通常被認為已經患有晚期肝癌。臨床數據表明，80%以上的HCC患者具有肝硬化或重度肝纖維化，幾乎所有患有肝細胞癌的患者都患有肝硬化[25-26]，而且肝硬化常阻礙對 HCC的有效治療。在一些發達國家，與肝硬化相關的HCC死亡率不斷上升，而非肝硬化為并發癥的肝癌死亡率則下降或保持穩定。研究表明，肝癌目前是代償性肝硬化患者與肝相關死亡的主要原因[23]。
2 細胞外基質的作用及體外模擬
2.1 細胞外基質參與調節細胞生理過程
所有組織和器官都包含細胞和非細胞成分，由細胞分泌到細胞外的大分子物質，如膠原蛋白、層黏連蛋白、蛋白聚糖等，形成了良好的組織網絡，稱為細胞外基質(ECM)。ECM不僅為細胞提供物理支架，還含有大量的信號分子，積極參與許多細胞過程，包括生長、遷移、分化、存活、體內穩態和形態變化等。ECM可為細胞提供結構支持和錨定位點，并賦予部分組織的生物力學特性[27-28]。ECM蛋白也可以直接通過它們的受體(如整聯蛋白)或通過調節生長因子將信號轉導給細胞[29]。ECM引導信號轉導并調節基因轉錄，從而指導必要的組織形態和生理功能。ECM在生理、發育和衰老中起著關鍵作用[30]。越來越多的報道揭示ECM的機械性質在細胞功能調節中起著至關重要的作用[31-32]。ECM的生物化學、生物力學、組織特性和保護性在不同組織之間，甚至在一個組織從一種生理狀態到另一種生理狀態(正常與癌變)之間，都可能有很大差異[33]。
2.2 基質硬化與腫瘤發展
目前，ECM對腫瘤細胞侵襲和轉移的生化作用已有較多的文獻記載[34]，但對它們的生物物理信號作用的研究相對較少。Ulrich等[35]發現隨著ECM硬度降低到與正常腦組織相當的值，腫瘤細胞變得圓潤并且無法有效遷移。此外，細胞增殖受ECM硬度的調節也較為明顯，與軟的ECM相比，較硬的ECM能促進細胞的分裂。基質硬化是實體瘤最顯著的機械和物理特征，主要是由于細胞外基質蛋白過度沉積和交聯所致[36]。癌細胞與癌癥相關的成纖維細胞和巨噬細胞協同工作，通過一些活動調節ECM：一些沉積結構成分的增多(如例如膠原蛋白I[37]，膠原蛋白II，III，V，IX[38]);各種生長因子和細胞因子的分泌(如IGF1，EGF，TGFβ，VEGF[39]，賴氨酰氧化酶[40])。在這些活動增多的情況下，癌細胞募集并轉化基質細胞，繼而協調基質的拓撲結構重構，機械剛度增加。而機械剛度增加可能會破壞細胞表面力的平衡，促進整聯蛋白聚集和粘著斑形成，從而將外源基質產生的力信號傳遞到細胞中，并最終影響它們的生物學表型和特性，例如細胞的形態、生長、分化，以及蛋白質、細胞因子的合成分泌和代謝[41-42]，還通過細胞骨架重塑來調節細胞遷移。癌癥轉移需要腫瘤細胞侵入基質，并使腫瘤細胞通過基質直接向脈管系統和淋巴系統遷移，之后擴散和定殖次級器官。在原發性腫瘤組織內形成的物理和生化梯度會促進腫瘤細胞的侵襲，并推動腫瘤細胞向血管和淋巴管的持續遷移，從而促進腫瘤細胞的擴散[43]。基質與癌細胞之間這種復雜的相互作用形成了基于生物化學和生物物理信號作為調節因素的動態前饋/反饋回路。因此，生物物理信號逐漸成為人們研究癌癥轉移的關鍵切入點[44]。
2.3 體外模擬細胞外基質的常用材料
水凝膠是一種親水性的三維網絡高分子材料，具有良好的生物相容性，根據來源可分為天然水凝膠和合成水凝膠。常用的天然水凝膠主要有膠原蛋白、透明質酸和海藻酸;常用的合成水凝膠主要包括聚丙烯酰胺、聚乙二醇等。通過選擇適當材料和化學成分，合理設計水凝膠的相關關鍵特性，例如機械剛度、彈性、含水量、生物活性、孔隙度和降解性[45]，從而模擬天然ECM相似的生物學和物理學特性。水凝膠化學的主要目的是構建用作3D離體組織模型的水凝膠，從而能夠通過復制組織的動態和非線性物理特性來探索細胞生物學中的基本問題。將水凝膠作為離體組織模型進行細胞3D培養已經揭示了一些協調細胞行為和組織的基本現象[46]。水凝膠已成為體外模擬構建生物體內環境的一種重要材料。
3 基質硬度對肝癌發展的影響研究現狀
3.1 腫瘤微環境在肝癌進展中的作用
體內腫瘤細胞在原發腫瘤部位和遠處轉移部位均存在各種類型的微環境。了解這些微環境的各種機械特性如何在腫瘤發展過程中影響腫瘤細胞的生物學特征，對于確定癌癥治療的分子靶標至關重要[41]，因此腫瘤微環境(TME)在癌癥進展中的作用正受到廣泛關注。TME具有明顯的異質性，并參與腫瘤的生長、轉移和耐藥性。模仿這種多樣化的微環境對于理解腫瘤的生長和轉移具有重要意義[47]。細胞外基質蛋白作為腫瘤微環境中最豐富的非細胞固態成分，不僅維持腫瘤細胞/組織的三維形態結構，而且還產生有關腫瘤細胞生物學功能的生化或生物物理信號[36]。肝臟中的TME在原發性和轉移性肝腫瘤的形成、生長中起著重要作用。TME的細胞和非細胞成分會顯著影響腫瘤的發展、生長、轉移、擴散、抗腫瘤免疫力以及對腫瘤治療的反應[48]。越來越多的數據表明，腫瘤與其微環境的相互作用在HCC發病機理中起著重要作用：TME積極參與肝纖維化、肝癌發生、EMT、轉移和侵襲的調節[49]。
3.2 肝臟硬度隨肝癌發展的變化
肝臟硬度被視為與纖維化相關，并且隨著纖維化程度的加深肝臟硬度增加[18]。2003年Sandrin等[50]引入基于超聲的瞬時彈性成像技術(目前在臨床上廣泛應用于測量肝臟硬度)，他們對多期肝纖維化的肝臟硬度進行了測量(如圖2[50]所示)。纖維化的等級范圍從F0到F4(F0：無纖維化，F1：無隔墊的門脈纖維化，F2：少隔，F3：無肝硬化的隔墊，F4：肝硬化)，結果顯示隨著纖維化的發生，肝臟硬度從正常狀態的2.5 kPa增加為肝硬化狀態的75.5 kPa。2016年Perepelyuk等[51]為了更好地了解正常和纖維化肝臟的力學特征，使用平行平板流變儀進行了一系列研究，測量了對壓縮、拉伸和剪切應變的響應。研究表明，大鼠肝臟中隨著進行性纖維化的增加，剪切儲能模量[(G′)]、損失模量[(G″)]和楊氏模量顯著增加，并且隨著壓縮力的施加，剪切模量顯著增加。說明晚期纖維化肝組織與早期纖維化肝組織或正常肝相比，晚期纖維化肝組織具有較高的壓力抵抗能力。
此外，已有廣泛報道稱肝臟是粘彈性組織，具有非線性的機械性質，其彈性和粘滯性能隨時間和形變而變化[51]。肝細胞外基質在纖維化過程中發生質和量的變化，其中纖維狀膠原蛋白顯著增加。這些機械性質相關的ECM蛋白和多糖變化，可能有助于并改變細胞行為，并且對組織的非線性力學具有重大影響。
3.3 基質硬度對肝癌發展的影響
基底硬度影響肝癌細胞的細胞形態和增殖：2011年Schrader等[7]為明確基質硬度的變化是否調節HCC細胞增殖和化療反應，在不同硬度聚丙烯酰胺(PA)凝膠表面培養肝癌細胞系HuH-7和HepG2。結果表明，柔軟(1 kPa)的凝膠上的肝癌細胞形態較小且呈現圓形，而在硬(12 kPa)凝膠上則為更加伸展且扁平形態的細胞(圖3a)[7])。此外，增加基質硬度可促進HCC增殖，基質硬度對G1期的細胞周期調節因子的表達具有相應的作用;基質硬度可調節化療后HCC細胞凋亡和克隆形成能力：順鉑治療后，在較硬的凝膠上培養的細胞凋亡減少，軟凝膠上的細胞克隆形成能力增強。證明機械因素能夠調節HCC細胞的形態、增殖和化學治療反應。這對原發性HCC的治療和預防播散性腫瘤細胞生長具有重要意義。
基底硬度影響肝癌細胞的遷移性：2020年Liu等[52]為了研究ECM剛度對HCC細胞的遷移的作用，制備了具有3種剛度(6，25和54 kPa，匹配正常肝，肝硬化和肝癌組織的生理硬度)的聚丙烯酰胺水凝膠，通過劃痕法和transwell法測定HCC細胞的遷移能力。結果表明，HepG2和MHCC97L細胞的遷移能力均隨水凝膠剛度的增加而顯著增加(圖3b)[52])，較硬的基質通過上調需氧糖酵解來促進HCC細胞的遷移。而YAP作為細胞微環境機械力學的傳感器，它的活性和亞細胞定位也受ECM剛度調節：YAP定位在細胞核中的量隨基質剛度的增加而增加。ECM剛度通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路誘導YAP激活來調節HCC細胞的遷移。確定了涉及YAP的MAPK依賴性調節網絡。揭示了受ECM力學調節的HCC細胞遷移機制，使我們更好地了解了機械力學環境對肝癌發生發展的影響。
基底硬度調控肝癌細胞的上皮細胞-間充質轉化：2019年Dong等[36]建立具有不同肝硬度背景的布法羅大鼠HCC模型和具有可調硬度的體外Col I涂層培養細胞來研究基質硬度對上皮細胞-間充質轉化(EMT)發生的影響及其潛在的分子機制。結果表明在較高硬度的肝臟中生長的HCC異體移植物表現出較差的惡性表型和較高的肺轉移率，較高的肝臟硬度會促進HCC的侵襲和轉移。體外細胞實驗表明，較高的基質硬度能夠顯著增強惡性表型并獨立誘導HCC細胞中的EMT發生，并且存在于Snail表達的3個信號通路參與了剛度介導的EMT發生，包括整合素介導的S100A11膜易位，eIF4E 磷酸化和TGFβ1自分泌(圖3c)[36])。此外，剛度誘導的EMT所需的關鍵分子在肝硬度較高的HCC患者的腫瘤組織中高表達，并且與較少的腫瘤分化和更高的復發率相關。突出表明了生物力學信號在觸發EMT和促進HCC侵襲和轉移中的重要作用。
基底硬度參與肝癌細胞的耐藥性發展：2019年Gao等[6]的研究誘導了HCC細胞中的索拉非尼耐藥細胞系，觀察發現索拉非尼耐藥細胞的細胞形態、細胞骨架結構和細胞剛度發生了變化，類似于生長于較硬基底上的細胞。為了研究機械因素在HCC細胞生長和耐藥性中的作用，他們使用了一種硬度可調的體外細胞培養系統，模擬正常和肝硬化的肝組織，發現在較硬基底的肝癌細胞運動性增加，索拉非尼耐藥性增加(圖3d)[6])，還具有更大的侵襲潛力。通過小干擾RNA沉默YAP基因，消除了基質硬度對肝癌細胞的索拉非尼耐藥性影響，證明YAP介導了HCC細胞中機械適應誘導的索拉非尼耐藥性。因此，通過調控機械微環境及其所介導的YAP信號通路對克服肝癌細胞的耐藥性具有重要意義。
水凝膠調控HCC發展的研究現狀小結：現在關于基質硬度調節HCC發展的研究多使用合成水凝膠——聚丙烯酰胺凝膠[6-8，36，52-54]作為“機械可調”基質涂層，設計不同硬度來模擬正常和纖維化肝臟中遇到的值，在凝膠表面培養肝癌細胞：發現增加基質硬度改變HCC細胞形態[7]，促進HCC增殖[7]、遷移[52]、EMT[36]，增強耐藥性[6]，抑制凋亡[53]。但是聚丙烯酰胺凝膠不具備生物組織常有的非線性力學性質，而且多數工作是將細胞培養在水凝膠表面，并未將細胞包裹在水凝膠內部，不能充分地模擬肝癌組織的三維動態環境和非線性物理特性。這些研究結果啟發我們設計并使用更具仿生特點的水凝膠來研究三維環境對HCC發展的影響，從而更好地探索肝癌發展中的基本問題。
4 結語與展望
腫瘤生物物理學為理解癌癥和發現新療法提供了新的思路。通過對基質力學性質與癌癥發生、發展關系的不斷深入研究，調控細胞外基質的機械性質可成為癌癥治療和預后的新靶標。ECM的硬度對肝癌細胞行為有相當大的影響，并且在癌細胞轉移過程中起著非常重要的作用。肝硬度的增加在驅動HCC惡化和進展中起有害作用，并表現出高風險的不良后果，已成為肝癌的一個重要的臨床病理參數并表示肝癌的病理分級[55]。隨著正常肝向肝纖維化、肝硬化、肝癌的發展，肝臟組織的硬度不斷增加，而增加的肝臟硬度又促進肝癌細胞生長、增殖、遷移、侵襲、EMT和耐藥性，促進了HCC惡化和發展。肝基質硬度可能充當改變腫瘤行為和進展的關鍵調節劑。
開發在離體仿生3D平臺研究細胞—基質相互作用可以幫助我們更好地了解物理因素如何影響化學信號，從而影響肝癌的發展惡化。目前大多數工作是基于天然水凝膠或合成水凝膠來模擬肝癌發展中ECM的不同硬度。但生物組織的機械性質除硬度不同外，還具有粘彈性、可塑性、應力剛化等非線性力學性質。然而，大部分合成水凝膠不具有天然ECM的非線性力學特點，不能夠很好的模擬天然ECM。因此，很少有適合的材料能夠用來研究基質非線性機械性質對細胞功能的調控。2013年，Rowan&Kouwer課題組設計、開發了一種具有機械響應性能的仿生水凝膠——螺旋聚異腈多肽(Polyisocyanopeptide，PIC[56])。PIC水凝膠在生物的硬度范圍內展示出超強的力學響應能力，即應力剛化的性質，隨著外界應力的增加PIC水凝膠的強度增強。該性質一般主要存在于膠原蛋白、中間纖維等天然生物凝膠中，在人工合成的水凝膠中很少被觀察到。基于其仿生的應力剛化性質，PIC水凝膠已成功用于調控干細胞的誘導分化[57]。由于PIC高度的仿生特性，并且可以通過鏈長、濃度等參數設計調整PIC水凝膠的機械性質，從而可以很好的模擬腫瘤的硬度和其他非線性力學特性，以便研究這些特性對腫瘤侵襲性和轉移潛力等的影響。因此，未來基于仿生水凝膠的非線性力學性質研究其對肝癌細胞的功能調控，對進一步理解肝癌微環境如何通過復雜機械信號調控肝癌的發展具有重要意義。
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