〔摘要〕 目的 研究婦科千金膠囊對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖及免疫調(diào)節(jié)的影響。方法 分離制備小鼠脾淋巴細(xì)胞，將細(xì)胞分為空白組(不做任何處理)，刀豆蛋白A組(刀豆蛋白A干預(yù)，ConA組)，LPS組(脂多糖干預(yù)，LPS組)及不同濃度的婦科千金膠囊組(FKQ)，作用時(shí)間分別為24 h、48 h和72 h。CCK8法檢測(cè)FKQ對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響;MTT法檢測(cè)ConA及LPS對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+的比例并計(jì)算CD4+/CD8+的比值;ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表達(dá)。結(jié)果 FKQ對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞有顯著的增殖作用，以濃度為30、40、50 μg/mL時(shí)其作用越明顯(P<0.01);FKQ能對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞及LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有著明顯的促進(jìn)作用，以濃度為50 μg/mL最顯著(P<0.01);中、高濃度的FKQ協(xié)同ConA能升高CD4+的比例，降低CD8+的比例，顯著升高CD4+/CD8+的比值(P<0.01)。此外，不同濃度的FKQ均能明顯增加IFN-γ及IL-2的表達(dá)(P<0.01，P<0.05)，降低IL-4和IL-10的水平，以中、高濃度最為顯著(P<0.01)，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。結(jié)論 婦科千金膠囊可有效促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，升高CD4+和CD8+比例，促進(jìn)Th1細(xì)胞因子的分泌，使Th1/Th2亞群向“Th1漂移”，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，提高細(xì)胞免疫應(yīng)答。

　　〔關(guān)鍵詞〕 婦科千金膠囊;脾淋巴細(xì)胞;增殖;免疫調(diào)節(jié);Th1/Th2

　　婦科千金膠囊(FKQ)是中國(guó)中藥保護(hù)品種，收載于2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部，由千斤拔、金櫻根、穿心蓮、單面針、功勞木、雞血藤、當(dāng)歸、黨參8味中藥材組成，具有清熱除濕、益氣化瘀的功效。常用于濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，癥見(jiàn)帶下量多、色黃質(zhì)稠、臭穢、小腹疼痛、腰骶酸痛、神疲乏力等，既標(biāo)本兼治，又扶正祛邪，臨床上廣泛用于婦科炎癥，療效甚佳。方中千斤拔祛風(fēng)利濕解毒，金櫻根清熱利濕止帶，二者同為君藥;穿心蓮和功勞木清熱除濕，二者同為苦寒之品，合用使全方清熱解毒之力增強(qiáng);單面針以其辛溫之性，可防穿心蓮、功勞木過(guò)于苦寒而傷胃，使全方藥性更趨平和，無(wú)傷正氣之虞，三者共為臣藥。當(dāng)歸補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛，雞血藤補(bǔ)血、活血、通絡(luò)，二者合用既能補(bǔ)血調(diào)經(jīng)，又能暢利血行而加強(qiáng)全方清熱除濕、活血解毒之功能;黨參補(bǔ)中益氣、生津養(yǎng)血，與當(dāng)歸、雞血藤合用氣血雙補(bǔ)、扶正固本，使全方融扶正、祛邪為一體，三者共為佐藥。諸藥合用使機(jī)體正氣得以充養(yǎng)，邪氣得以祛除，故諸癥消除。

　　中醫(yī)學(xué)十分重視人體的正氣，強(qiáng)調(diào)正氣是發(fā)病的主導(dǎo)，認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干;邪之所湊，其氣必虛”。意指當(dāng)人的正氣在內(nèi)，氣血充足的時(shí)候，即機(jī)體免疫力正常，“外邪”即致病菌不容易侵犯機(jī)體致病;而當(dāng)人體正氣受損，即免疫功能低下時(shí)，致病菌容易乘虛而入發(fā)病。FKQ的治療理念在清除致病菌的同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體免疫力，后期通過(guò)強(qiáng)化自身免疫能力而防治疾病反復(fù)發(fā)作。脾臟作為機(jī)體最大的外周免疫器官，是T、B淋巴細(xì)胞的主要聚集場(chǎng)所，而T、B淋巴細(xì)胞作為機(jī)體免疫活性細(xì)胞，其激活、分化、增殖在免疫應(yīng)答過(guò)程中起著重要的作用[1]。關(guān)于FKQ能調(diào)節(jié)由環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫功能障礙及FKQ組分中藥對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)研究較多[2-5]，但尚無(wú)FKQ對(duì)體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞的免疫增強(qiáng)活性的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以FKQ為研究對(duì)象，研究其對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖及免疫調(diào)節(jié)的影響，以期為FKQ提高免疫作用機(jī)制的研究及開(kāi)發(fā)利用奠定理論依據(jù)。

　　1 材料

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　20只健康BALB/c雌性小鼠，體質(zhì)量16～18 g，6～7周齡，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲食飲水，實(shí)驗(yàn)程序由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

　　1.2 藥品與試劑

　　婦科千金膠囊(FKQ)(產(chǎn)品批號(hào)20170231，株洲千金藥業(yè)股份有限公司);CCK8(CA1210，北京索萊寶科技有限公司);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(16000-044，美國(guó)gibco公司);1640培養(yǎng)基(C11875500BT，美國(guó)gibco公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(SH30022.01，Hyclone公司);ConA刀豆蛋白、LPS脂多糖及MTT噻唑蘭(批號(hào)分別為C8110、L8880、M8180，北京索萊寶科技有限公司);Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10 ELISA Kit(批號(hào)為PI508、PI575、PI612、PI522，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

　　1.3 儀器

　　47103離心機(jī)(Eppendorf中國(guó)有限公司);SW-CJ-2FD蘇州凈化超凈工作臺(tái)(上海葉拓科技有限公司)、Blender 快速組織細(xì)胞破碎儀(美國(guó) NextAdvance 公司)、Cyto-Flex 流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)。

　　2 方法

　　2.1 小鼠脾臟細(xì)胞的分離

　　將小鼠腹腔麻醉后，頸椎脫臼處死，75%酒精將小鼠浸泡15 min;在超凈臺(tái)中取出小鼠脾臟，去除筋膜后反復(fù)用PBS沖洗至無(wú)血色;將脾臟置于200目細(xì)胞篩上，注射器研磨，用PBS沖洗6次后置于培養(yǎng)皿中;收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心10 min，棄上清;加入10%紅細(xì)胞裂解液適量，室溫靜置10 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清;PBS清洗3遍，1 500 r/min離心10 min，棄上清;加入0.85%NaCl溶液重懸沉淀;密度梯度離心加樣，1 800～2 000 r/min離心40 min;收集目標(biāo)分層，PBS清洗3遍;RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中37 ℃、5%CO2孵育3 h，去除貼壁細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

　　2.2 CCK8法檢測(cè)FKQ對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖作用

　　將FKQ設(shè)置成10、20、30、40、50 μg/mL，不同藥物濃度孵育小鼠脾淋巴細(xì)胞24 h、48 h和72 h。將處理完成的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，將1×104的細(xì)胞數(shù)接種到96孔板中，每孔約100 μL細(xì)胞懸液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12 h使其貼壁。每孔加入10 μLCCK8繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，吸光度值與細(xì)胞的增殖能力成正比。

　　2.3 MTT法檢測(cè)FKQ對(duì)ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

　　細(xì)胞分離、接種方法同前，參考文獻(xiàn)[6]，本實(shí)驗(yàn)分為空白組，模型組(ConA，5 μg/mL)，F(xiàn)KQ組：不同濃度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分別干預(yù)ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞。于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法檢測(cè)FKQ對(duì)ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖功能，測(cè)定方法同CCK8法。

　　2.4 MTT法檢測(cè)FKQ對(duì)LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

　　細(xì)胞分離、接種方法同前，參考文獻(xiàn)[7]，本實(shí)驗(yàn)分為空白組，LPS組(LPS，10 μg/mL)，F(xiàn)KQ組：不同濃度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分別干預(yù)LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞。于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖功能。

　　2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+亞群的變化

　　將脾淋巴細(xì)胞(1×108)加入24孔板，設(shè)空白組、ConA組(ConA，5 μg/mL)和FKQ組：不同濃度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分別干預(yù)ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞。每組均有3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育48 h，離心收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖溶液清洗，然后使用小鼠單克隆抗體CD4+-FITC或者CD8+-FITC孵育后磷酸鹽緩沖溶液清洗，流式檢測(cè)CD4+和CD8+的百分比。

　　2.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量

　　將脾淋巴細(xì)胞(1×108)加入96孔板，設(shè)空白組(不做任何刺激)、ConA組(ConA刺激)、LPS組(LPS刺激)和FKQ組：不同濃度的FKQ(10、30和50 μg/mL)分別干預(yù)ConA誘導(dǎo)脾T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)脾B淋巴細(xì)胞，每組均有3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育48 h，收集細(xì)胞上清，2 000 r/min室溫離心5 min，取上清，按說(shuō)明書操作，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。

　　2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件整理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“x±s”表示，當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)，多組間比較使用單因素方差齊性分析(One-way ANOVA)，當(dāng)P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　3 結(jié)果

　　3.1 FKQ對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖作用

　　對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分別孵育24 h、48 h和72 h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞孵育24 h，濃度為10、20 μg/mL的FKQ對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖無(wú)差異(P>0.05);濃度在30、40、50 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖有著顯著的促進(jìn)作用(P<0.01)。當(dāng)孵育細(xì)胞48 h，與濃度為10 μg/mL的FKQ相比，濃度在20、30、40、50 μg/mL時(shí)能明顯增加脾淋巴細(xì)胞增殖(P<0.01)，且隨著劑量的增加其增殖作用越明顯。細(xì)胞孵育72 h后，30 μg/mL的FKQ對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用(P<0.05);40、50 μg/mL的FKQ對(duì)細(xì)胞增殖促進(jìn)作用更為明顯(P<0.01)。其他濃度組的細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明各濃度組藥物對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。與培養(yǎng)24 h相比，F(xiàn)KQ濃度為10、30、50 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)48 h與72 h，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖無(wú)影響(P>0.05);FKQ濃度為20、40 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)48 h時(shí)能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01)。見(jiàn)表1。

　　3.2 FKQ對(duì)ConA誘導(dǎo)脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響

　　由表2可知，與ConA組相比，10～50 μg/mL的FKQ對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖具有顯著性差異(P<0.01)，有顯著的量效關(guān)系，但只在24 h時(shí)劑量依賴性最明顯;細(xì)胞孵育48 h及72 h時(shí)，F(xiàn)KQ濃度在10 μg/mL和30 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖作用差異較小，而當(dāng)其濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，其差異變化較大。

　　3.3 FKQ對(duì)LPS誘導(dǎo)脾B淋巴細(xì)胞增殖的影響

　　由表3可知，LPS在不同的孵育時(shí)間對(duì)B淋巴細(xì)胞都有明顯增殖促進(jìn)作用;10～50 μg/mL的FKQ對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖存在明顯差異(P<0.05，P<0.01)，在細(xì)胞孵育24 h及72 h時(shí)劑量依賴性最明顯;當(dāng)細(xì)胞孵育24 h及72 h時(shí)，F(xiàn)KQ濃度在10 μg/mL和30 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖作用差異較小，而當(dāng)其濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，其差異變化較大。當(dāng)細(xì)胞孵育48 h時(shí)，F(xiàn)KQ濃度在10 μg/mL和30 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖作用差異最大，濃度在50 μg/mL時(shí)，其差異最小。

　　3.4 FKQ對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+亞群的影響

　　如圖1所示，與對(duì)照組相比，在ConA的刺激下，CD4+ T細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)，而隨著FKQ的濃度升高CD4+ T細(xì)胞的比例出現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但低濃度FKQ與ConA協(xié)同效果不明顯，而當(dāng)FKQ達(dá)到中、高濃度時(shí)開(kāi)始與ConA產(chǎn)生協(xié)同作用(P<0.01);經(jīng)ConA刺激后CD8+ T細(xì)胞比例降低;中、高濃度FKQ協(xié)同ConA能顯著升高CD4+/CD8+比值，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能(P<0.01)。說(shuō)明中、高濃度的FKQ與ConA能產(chǎn)生協(xié)同作用，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡。

　　3.5 FKQ對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞INF-γ、IL-2、IL-4及IL-10表達(dá)的影響

　　表4結(jié)果顯示，與空白組相比，單用ConA和LPS刺激均能顯著增加IFN-γ、IL-2的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05);與單用ConA及LPS刺激相比，ConA協(xié)同50 μg/mL FKQ能促進(jìn)IL-2的表達(dá)，LPS協(xié)同不同濃度的FKQ對(duì)IFN-γ、IL-2的表達(dá)均有顯著促進(jìn)作用(P<0.01)，同時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，ConA及LPS的刺激顯著降低了細(xì)胞中IL-4的表達(dá)(P<0.01，P<0.05)，而增加IL-10的表達(dá)(P<0.01)。與單用ConA及LPS刺激相比，F(xiàn)KQ協(xié)同ConA、LPS刺激均能降低IL-4、IL-10的表達(dá)，尤以中、高濃度最為顯著(P<0.01)。

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