【摘要】 血管緊張素轉化酶2(ACE2)可能通過腎素血管緊張素醛固酮系統(RAAS)或通過對一些新型調節肽系統的調制作用來調節心血管的功能, 但是否參與AMI后機體對心肌缺血缺氧的調節反應還不清楚. 我們從基因轉錄水平(mRNA)觀察SD大鼠AMI后梗死區及非梗死區的左心室肌細胞ACE2 mRNA表達量的變化.

　　【關鍵詞】 大鼠,ACE2 mRNA,心肌梗死

　　0引言

　　1材料和方法

　　1.1材料總RNA抽提試劑盒(Trizol試劑盒)由Invitrogen公司提供, RTPCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司. ACE2引物及內參基因引物, 以及PCR產物測序由上海生物工程技術服務有限公司完成. 低溫離心機(賀利氏228RS，德國). 紫外光分光光度儀(導津22201，日本), PCR 儀(Biometra，德國)，電泳儀(京華，中國北京). 全自動凝膠成像分析系統(法碼西亞，美國). SD大鼠(武漢大學醫學院實驗動物中心提供)36只。

　　成年雌性，質量200~250 g，隨機分為1 d組(n=12), 3 d組(n=12), 28 d組(n=12). 每組再隨機分為對照組(假手術組)、手術組(心梗組)2個亞組. 大鼠用200 g/L烏拉坦(200 mg/kg) ip麻醉，同時行氣管插管，接小動物呼吸機給予通氣. 然后左側開胸術，打開心包，用5~0絲線在左心耳下1～2 mm處結扎左前降支近端. 其成功標志為：心電圖ST段弓背向上抬高或出現病理性Q波，直視下可見被結扎血管供應區心肌變為蒼白色或發生區域性運動障礙. 對照組重復上述步驟，不結扎冠狀動脈. 結扎中存活的大鼠和對照組大鼠接受相同的飼養條件，包括任意食物，水和每12 h晝/夜循環. 術后給予青霉素100 000 U im預防感染.

　　1.2方法烏拉坦麻醉下打開胸腔, 迅速取出心臟，置于4.0℃預冷的生理鹽水漂洗除去過量的血液. 小心切去右心室和右心耳，僅保存左室非梗死區域及梗死區域. 剪碎后，放入液氮中保存. 取左室梗死區和非梗死區心肌組織各100 mg，用Trizol試劑抽提心肌組織總RNA，各RNA樣本A260 nm/A280 nm的比值均為1.8～2.0. 根據Genebank的序列，并參考相關文獻[1]，分別設計ACE2，GAPDH，并由上海生物工程技術服務有限公司合成. 用RTPCR試劑盒進行逆轉錄和擴增反應. PCR反應體系：cDNA 4 μL, Takara Taq 0.5 U，MgCl2 30 μmol/L，8 pmol上下游引物，10×PCR Buffer，加入去離子水至總體積20 μL.

　　GAPDH基因反應條件：94.0℃ 5 min，首次循環94.0℃ 30 s，55℃ 30 s，72.0℃ 45 s，共32個循環，結束前72.0℃ 10 min，4.0℃ 5 min. ACE2基因反應條件：94.0℃ 5 min，首次循環94.0℃ 30 s，57℃ 30 s，72.0℃ 45 s，共32個循環，結束前72.0℃ 10 min，4.0℃ 5 min. PCR產物經20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，用全自動凝膠成像分析系統對凝膠成像，用ImageTool2.0分析各電泳條帶灰度積分，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的灰度積分作為標準校正. ACE2 PCR產物的相對量=ACE2電泳條帶灰度積分/GAPDH電泳條帶灰度積分，進行半定量分析. 對PCR產物進行測序，由上海生物工程有限公司測序部完成.

　　統計學處理：所有數據以x±s表示, 應用SPSS 11.5統計軟件，組間均數比較用方差分析，P<0.05認為有統計學意義.

　　2結果

　　應用PCR上下游引物對其產物進行正向和反向測序，把目標基因擴增片段測序結果與Gene Bank目標基因全序列應用Blast引擎進行比較，目標基因ACE2被擴增片段的序列與其所在基因上的相應序列一致(圖1). 在d 1，與假手術組相比，手術組梗死區及非梗死區ACE2 mRNA水平均無差異(P>0.05，表1). 在d 3，與假手術組相比，手術組梗死區ACE2 mRNA水平明顯升高(P<0.01)，手術組非梗死區ACE2 mRNA水平無改變;與手術組非梗死區相比，手術組梗死區ACE2 mRNA水平明顯升高(P<0.01). d 28，與假手術組相比，手術組梗死區及非梗死區ACE2基因mRNA均水平明顯升高(P<0.01);與手術組非梗死區相比，手術組梗死區ACE2 mRNA水平無差異.

　　A: 1 d; B: 3 d; C: 28 d.1: 假手術; 2: 非梗死區; 3: 梗死區; M: Marker.

　　圖1大鼠AMI后ACE2 mRNA表達水平(略)

　　表1大鼠AMI后ACE2 mRNA水平變化(略)

　　bP<0.01 vs假手術和急性心梗非梗死區; cP<0.01 vs假手術.

　　3討論

　　近年來有研究表明，ACE2在人和嚙齒類動物的心臟中高度表達，而且ACE2的作用與ACE相拮抗，ACE將AngⅠ轉化為強的縮血管物質AngⅡ，ACE2則將AngⅡ轉化為強舒血管物質Ang17，從而平衡腎素血管緊張素系統，達到調節心臟功能的作用[2].

　　又有報道表明RAAS的組成成分ACE, AngⅡ等在AMI后被激活[3]，但AMI后有關ACE2的研究尚未見報道. 本研究發現在大鼠AMI的早期(d 3)，梗死區ACE2 mRNA的表達即增加，并持續到第28日，到第28日非梗死區ACE2 mRNA的表達也增加. AMI后ACE2的增加可能對心肌缺血后激活的腎素血管緊張素系統進行負性平衡調節起到重要作用，主要是通過增加舒血管物質Ang17的水平來限制心肌AngⅡ水平增加產生的負效應，從而有利于心臟功能的保護Crackower等[4]

　　研究發現小鼠在ACE2基因敲除后表現出心室腔擴大和心肌收縮能力減退，AngⅡ水平增加，而且缺氧誘導基因的表達增多，進一步將ACE和ACE2雙基因敲除后，發現與ACE2敲除小鼠相比，雙基因敲除小鼠心功能完全正常. 充分說明了ACE2能夠調節心臟的收縮性，降低心臟的AngⅡ水平，及減少缺氧誘導基因的表達. 目前有研究發現：G蛋白藕聯受體(Mas)是Ang17的高親和力功能性受體，Ang17是一種血管舒張因子，通過與特異性受體Mas結合，通過激肽、NO，前列腺素等途徑拮抗AngⅡ所產生的病理生理效應[5-6].

　　因此推斷ACE2對AMI及其后的心衰的保護效應可能是通過調節心臟的收縮性，降低心臟的AngⅡ水平，生成一定量的Ang17及減少缺氧誘導基因的表達等一系列效應來發揮的. 本試驗還發現ACE2也參與了AMI后期非梗死區心肌細胞的保護作用，其保護途徑可能與上面類似. 總之，本研究表明通過提高ACE2水平可能為心梗及隨后的心衰的治療提供一種可能性. 對ACE2 和Ang17作用的干預將可能是今后治療心血管和其他相關疾病的一個很有前途的發展方向.