摘 要：過(guò)氧化氫酶是生物體內(nèi)的一種末端氧化酶，可以減輕甚至清除過(guò)氧化氫在體內(nèi)聚積對(duì)機(jī)體造成的損傷，調(diào)控過(guò)氧化氫酶的生物合成對(duì)機(jī)體具有十分重要的意義。通過(guò)在黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中分別加入不同的金屬離子，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞破壁，提取過(guò)氧化氫酶，檢測(cè)不同金屬離子對(duì)過(guò)氧化氫酶活力的影響。結(jié)果表明：在發(fā)酵培養(yǎng)的24h階段，增加CaCO3添加量，同時(shí)減少M(fèi)g2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-+等離子的含量，既可提高菌體的生長(zhǎng)速度，又可提高過(guò)氧化氫酶的產(chǎn)量。

　　關(guān)鍵詞：過(guò)氧化氫酶;金屬離子;生物合成;影響

　　過(guò)氧化氫酶(CAT)是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，能催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫分解，防止過(guò)氧化物的形成，從而使細(xì)胞免于遭受過(guò)氧化氫的毒害。在人體正常生理?xiàng)l件下，過(guò)氧化氫酶可催化過(guò)氧化氫的快速分解，使H2O2失去活性氧的作用，且效果十分顯著。過(guò)氧化氫酶還被廣泛應(yīng)用于面包和飲料的生產(chǎn)中，因其能分解H2O2產(chǎn)生O2和H2O的性質(zhì)，可將過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化氫共同作為烘烤食品的膨脹劑。過(guò)氧化氫酶在對(duì)牛奶飲料等的消毒上應(yīng)用更為廣泛。研究表明，利用過(guò)氧化氫酶降解工業(yè)廢水中過(guò)氧化氫，不僅可以避免對(duì)環(huán)境造成二次污染，同時(shí)對(duì)芳香和脂肪烴化合物進(jìn)行降解也相當(dāng)有效。過(guò)氧化氫酶價(jià)格低廉且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，已在很多含酚廢水的污水處理中得到廣泛應(yīng)用。在紡織生產(chǎn)過(guò)程中，過(guò)氧化氫酶還可快速安全地清除H2O2，既減少了染色布磨損，又有利于保護(hù)環(huán)境。過(guò)氧化氫酶還被廣泛應(yīng)用于工業(yè)酶催化中，降低工業(yè)酶催化過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物的積累或酶發(fā)生降解等不良影響。Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等是人體必需的生命元素，研究這些離子對(duì)過(guò)氧化氫酶穩(wěn)定性和酶活性的干擾具有生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。為此，筆者利用黑曲霉在不同離子作用的條件下發(fā)酵產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，測(cè)定酶活力，探討不同離子對(duì)過(guò)氧化氫酶生物合成的影響，以期通過(guò)控制離子含量來(lái)提高過(guò)氧化氫酶活性，進(jìn)而降低過(guò)氧化氫對(duì)機(jī)體造成的損害。

　　1 材料與方法

　　1.1 培養(yǎng)基制備 霉菌分離培養(yǎng)基(馬丁氏培養(yǎng)基)：K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂15～20g、水1000mL、1%孟加拉紅水溶液3.3mL，無(wú)菌操作時(shí)加1%的鏈霉素使其終濃度為30μg/mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：5% 葡萄糖、0.012% MgSO4、0.2% KCl、0.015% KH2PO4、0.06% NH4H2PO4、0.2%蛋白胨、0.3%牛肉膏。

　　1.2 菌種篩選 取適量土樣置于裝有無(wú)菌水的錐形瓶中攪拌，使采集的泥土分散成均勻的土壤懸液，將涂布好樣品的平板放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度28℃，倒置培養(yǎng)2～3d。

　　1.3 菌種發(fā)酵培養(yǎng) 接種篩選出的黑曲霉純培養(yǎng)物的種子液，30℃條件下?lián)u床，轉(zhuǎn)速為160rpm。將得到的種子液接種于含15%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液，接種量為10%(w/w)，溫度32℃，pH自然，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間48h。

　　1.4 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，離心后用緩沖液清洗沉淀，得到菌體細(xì)胞;將所得細(xì)胞用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破壁，細(xì)胞破碎儀功率為80W，超聲3s，共操作180～200次，每次間隔3s;細(xì)胞破壁工作結(jié)束后進(jìn)行離心操作，4000rpm/min，持續(xù)10min，取上層液體作為酶液，用紫外分光光度法測(cè)定其酶活力。酶活力的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：取6只小試管并分別編號(hào)，按表1所示依次加入對(duì)應(yīng)試劑，然后振蕩試管搖勻，在350nm處以0號(hào)管調(diào)零，繼而分別測(cè)定另外5只試管的吸光度。樣品檢測(cè)：依次加入1.5mL緩沖溶液、0.1mL酶提取液、1.2mL蒸餾水，然后加入0.2mL過(guò)氧化氫溶液，立刻計(jì)時(shí)4min后加入1mL硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定350nm吸收值。分別測(cè)定幾種金屬離子存在的條件下，黑曲霉培養(yǎng)24h及48h產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的活力，計(jì)算方法如下：

　　[E=aAK-AS+bwt×250.1] (1)

　　式中：AK為對(duì)照樣吸光度;AS為樣品吸光度;wt為反應(yīng)時(shí)間;a、b為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)參數(shù)。

　　1.5 菌體干重測(cè)定 取10mL發(fā)酵液，放在烘干且達(dá)到衡重的濾紙上進(jìn)行過(guò)濾，為使不溶的碳酸鹽溶解，加入2mol/L HCL使其轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿穆然}，然后用蒸餾水沖洗。將收集的濾液用細(xì)菌濾器再過(guò)濾，最后將吸附有菌體的過(guò)濾器在烘箱(100℃)內(nèi)干燥4h稱(chēng)重。分別測(cè)定幾種金屬離子存在的條件下，培養(yǎng)24h及48h的黑曲霉菌體重量。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 過(guò)氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程為y=1.215x+0.0311，截距(a)為0.0311，斜率(b)為1.215，相關(guān)系數(shù)R2=0.9916。

　　2.2 不同金屬離子對(duì)菌體生長(zhǎng)和條件以及過(guò)氧化氫酶的影響

　　2.2.1 pH 由圖2可知，培養(yǎng)液中添加了CaCO3能夠明顯抑制培養(yǎng)基pH下降，添加其他離子的培養(yǎng)液pH也較對(duì)照略高，但抑制pH下降的功能不明顯。

　　2.2.2 菌體干重 由圖3可知，除CaCO3以外，其他金屬離子在培養(yǎng)24h后對(duì)菌體生長(zhǎng)都具有一定的抑制作用，培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48h后，Cl-、PO43-菌體生長(zhǎng)具有小幅促進(jìn)作用，雖然加入了Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+的培養(yǎng)基中菌體干重依然低于對(duì)照，但高于同條件下培養(yǎng)24h的菌體干重，說(shuō)明Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+對(duì)菌體生長(zhǎng)依然有抑制作用;而CaCO3在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)菌體生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，加入了CaCO3培養(yǎng)48h后的菌體干重達(dá)到22.8mg/mL，這與CaCO3能夠抑制pH下降相關(guān)。

　　2.2.3 過(guò)氧化氫酶活力 由圖4可知，培養(yǎng)24h后，對(duì)照過(guò)氧化氫酶活力為32.4IU，而加入了CaCO3培養(yǎng)24h后的過(guò)氧化氫酶活力為112.9IU，明顯高于對(duì)照。由此可見(jiàn)，CaCO3對(duì)菌體生長(zhǎng)及過(guò)氧化氫酶的酶活力提高均具有明顯的促進(jìn)作用。除了加入ZnCO3的培養(yǎng)基外，其余金屬離子培養(yǎng)液中過(guò)氧化氫酶活力都高于對(duì)照，說(shuō)明Zn2+對(duì)過(guò)氧化氫酶活力具有最明顯的抑制作用。

　　3 結(jié)論與討論

　　試驗(yàn)結(jié)果表明：CaCO3對(duì)黑曲霉菌體生長(zhǎng)及過(guò)氧化氫酶的合成具有促進(jìn)作用。培養(yǎng)24h時(shí)，Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-對(duì)黑曲霉菌菌體生長(zhǎng)及過(guò)氧化氫酶的生物合成具有抑制作用;培養(yǎng)48h時(shí)，只有Zn2+對(duì)黑曲霉菌菌體生長(zhǎng)及過(guò)氧化氫酶的合成均具有抑制作用。因此，發(fā)酵工業(yè)上，在發(fā)酵培養(yǎng)的24h階段，可以通過(guò)控制CaCO3加入來(lái)提高菌體的生長(zhǎng)速度及過(guò)氧化氫酶的活力，同時(shí)要避免Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-等離子的產(chǎn)生;在發(fā)酵培養(yǎng)的48h期間，要避免Zn2+的產(chǎn)生，可以有效減輕過(guò)氧化氫對(duì)發(fā)酵的危害，使菌體保持較快的生長(zhǎng)速度，也可使過(guò)氧化氫酶的活力達(dá)到較高水平。

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