摘要 采用微生物分離純化技術從底泥樣品中篩選到一株絮凝菌，通過目標菌株的形態學特征和16S rRNA序列分析以鑒定其種屬，并對其發酵條件和絮凝條件進行優化。結果表明，XN1-4為黏質沙雷氏菌;XN1-4在發酵28 h后其發酵液的絮凝效果最好。菌株XN1-4的最佳培養條件為培養基初始pH 5.0、培養溫度25 ℃、搖床轉速150 r/min;最佳絮凝條件為發酵液投加量4%、助凝劑投加量4%。在最佳絮凝條件下，XN1-4的絮凝率達到98%，且絮凝活性成分主要存在于菌體本身。

　　關鍵詞 絮凝菌;分離鑒定;培養條件;絮凝條件;優化

　　隨著社會經濟的快速發展，人們生活水平的不斷提高，日益凸顯的河湖生態環境問題也越來越受到關注和重視。雖然，目前也采取了許多截污措施，但由于人口及工業的快速發展，水體富營養化等水生態環境問題仍然日益嚴重[1-3]，許多地方的河流及湖泊均出現了不同程度的水體富營養化現象，藻類大量繁殖、水體透明度和溶解氧都明顯降低[4]，不僅嚴重影響了水體生態系統，而且嚴重危害了人類的身心健康[5]。因此，高效修復富營養化等被破壞的水體成為亟待解決的生態環境問題。然而，目前對富營養化等受到破壞的水體多采用物理或化學等方法，效果并不十分理想，并且容易產生二次污染等問題，因此，迫切需要尋找一種高效且不產生二次污染等問題的方法。

　　微生物絮凝劑是一類微生物在生長繁殖過程中代謝分泌產生的一種高分子活性物質[6]，如蛋白質、多糖、脂類和核酸等[7-8]，能夠絮凝、沉降水體中的懸浮顆粒、色素等物質，具有安全高效、綠色環保、可生物降解等優點，不會引起二次污染[9-11]。陸洪省等[12]將絮凝菌SKDXN-1應用于富營養化水體的治理，該菌株處理富營養化水體10 d后，水中葉綠素a去除顯著，去除率達89.10%，對水體總氮、總磷和COD的去除率分別為10.5%、15.6%和44.5%，具有一定的生態修復效果。但由于微生物絮凝劑在實際水污染治理應用方面存在用量大、成本高的問題[13]，目前并沒有被廣泛應用于水體生態修復中，因此篩選高效絮凝劑產生菌、提高絮凝劑的絮凝效果、降低絮凝劑用量[14-15]，是該領域當前研究的重點[16-17]。

　　目前，絮凝劑產生菌大多是從活性污泥、土壤、河流、深海等環境中篩選而來[18-19]，以湖泊底泥為對象篩選絮凝菌的研究較少報道[20]。筆者以湖泊底泥為篩選對象，分離篩選到一株絮凝菌，通過形態學、生理生化以及16S rRNA進行菌種鑒定，并研究絮凝菌的最適培養條件和絮凝條件，為絮凝菌在水體生態修復中的應用奠定理論基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1 樣品來源

　　現場利用柱狀底泥采樣器采集漳州市峰頭水庫淺層底泥，準確稱取10 g淺層底泥樣品于無菌的250 mL三角瓶中，加入適量無菌水和玻璃珠，在旋渦振蕩器上充分振蕩均勻。

　　1.2 培養基

　　富集培養基：牛肉膏 5 g、 蛋白胨 10 g、 氯化鈉10 g，溶于蒸餾水中，調pH 7.2～7.4，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

　　分離培養基：在富集培養基的基礎上加1.5% 的瓊脂。通用發酵培養基：葡萄糖 20.0 g、KH2PO4 2.0 g、K2HPO4 5.0 g、 (NH4)2SO4 0.2 g、 NaCl 0.1 g、脲0.5 g、酵母膏 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g，溶于蒸餾水中，調pH 7.2～7.4，定容至1 000 mL，115 ℃滅菌30 min。

　　1.3 菌種富集與分離純化

　　吸取10 mL充分混勻的樣品溶液于裝有100 mL富集培養基的 250 mL 三角瓶中， 30 ℃ 150 r/min 振蕩培養48 h，待培養基渾濁后，再次轉移10 mL溶液至新的富集培養基中，同等條件下振蕩培養48 h，如此重復富集2～3次。取最終富集培養液，梯度稀釋至1×10-6、1×10-7、1×10-8，分別取100 μL涂布于分離培養基上，30 ℃培養48 h。挑取表面光滑黏稠的單菌落， 于分離培養基上多次平板劃線純化直至得到單菌落，斜面保存備用。

　　1.4 高效絮凝菌的篩選

　　分別挑取已分離純化的各菌株接種于裝有100 mL 通用發酵培養基中，在 30 ℃、150 r/min 的條件下振蕩培養 48 h后， 吸取2 mL菌液測定發酵液的絮凝活性，每次測定重復 3 次， 取平均值。

　　絮凝活性測定方法：取2 mL菌液、2 mL質量分數為1%的CaCl2溶液加入46 mL 0.4 g高嶺土懸浮液中，置于磁力攪拌機上攪拌，控制條件為200 r/min下快攪1 min，然后100 r/min下慢攪3 min。靜沉5 min，吸取上清液于550 nm下測定吸光度，同時以未接種的發酵培養基作為空白對照，確定菌株發酵液的絮凝活性。按照公式(1)計算絮凝率。

　　絮凝率=(A-B)/A×100%(1)

　　式中，A為未接種發酵培養基的OD550，B為樣品的OD550，以蒸餾水做參比。

　　1.5 絮凝菌的鑒定

　　1.5.1 形態學鑒定和生化鑒定。

　　將篩選得到的菌種接種于營養瓊脂培養基上， 在 30 ℃ 下培養 48 h， 對菌株進行革蘭氏染色， 油鏡下觀察菌體形態。用富集培養基將菌株在 30 ℃ 下培養至對數生長期，將菌液按照無菌操作技術接入細菌生化鑒定管中， 30 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養 48 h 后觀察記錄結果。

　　1.5.2 16S rRNA基因序列的測定分析。

　　使用DNA提取試劑盒提取目標菌株的基因組DNA，采用16S rRNA基因通用引物擴增獲得PCR產物，經電泳檢測后，直接交由上海生工進行測序，要求雙向測通。所得測序結果提交GenBank進行Blast序列比對分析。

　　1.6 絮凝菌的生長特性分析

　　將篩選獲得的絮凝菌在富集培養基中活化培養24 h，作為種子液。取2%菌種液轉接至通用發酵培養基中，培養溫度為30 ℃，搖床轉速為150 r/min，每隔4 h取樣1次，取樣時長為48 h，測定發酵液中的細菌密度(OD600)和絮凝率，以未接菌種液的培養液為對照。繪制菌株的生長曲線及絮凝率變化曲線，以確定最佳的發酵時間。

　　1.7 絮凝活性分布

　　吸取30 mL發酵液于50 mL離心管中，在5 000 r/min離心10 min，移取上清液至新的離心管中，用蒸餾水洗滌菌體沉淀2次，再用等體積的蒸餾水重懸菌體，制成細胞懸浮液。分別測定發酵原液(含細胞)、 上清液以及細胞懸浮液的絮凝率。

　　1.8 發酵條件優化

　　在其他培養條件不變(培養基初始pH為7.0，培養溫度為30 ℃，轉速為150 r/min)的基礎上，以其中的一個單因素為變量，發酵培養48 h后取樣測定絮凝率，分析不同培養條件對絮凝活性的影響，以得到目標菌株的最佳培養條件。①培養基初始pH：采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH，將初始pH分別調為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。②培養溫度：在上述已得到的最佳培養條件下，設定不同培養溫度(20、25、30、35、40 ℃)。③轉速：在上述已得到的最佳培養條件下，設定不同搖床轉速(100、120、150、180、200 r/min)。

　　1.9 絮凝條件優化

　　在最佳培養條件下，探討不同絮凝條件對目標菌株絮凝活性的影響，以確定最佳絮凝條件。①發酵液投加量：設定不同體積分數的發酵液投加量(1%、2%、3%、4%、5%)。②助凝劑投加量：設定不同體積分數的助凝劑投加量(1%、2%、3%、4%、5%)。

　　2 結果與分析

　　2.1 絮凝菌種篩選結果

　　經富集、分離、純化，從底泥樣品中共分離出20株菌落表面光滑黏稠的菌株，其中有17株具有絮凝活性。由表1可知，XN1-4、XN2-5、XN3-1、XN3-4這4株的初篩絮凝率均超過30%，可作為復篩備用菌株。