摘 要：利用鼠胚傳代培養細胞，制備細胞爬片，并分別運用考馬斯亮藍R250和FITC-鬼筆環肽來染色顯示細胞微絲，探索和改進實驗方法，以便有效觀察細胞微絲的分布和形態結構。結果顯示，采用鼠胚傳代培養細胞作為實驗材料，傳代成纖維狀細胞鋪展良好，經固定、通透并染色后，可在普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡下顯示微絲束在細胞中的分布，既便于實驗觀察，也有助于學生對微絲骨架作用的理解和掌握。
關鍵詞：微絲;細胞骨架;熒光顯微鏡
在細胞內，微絲是由肌動蛋白分子螺旋狀聚合形成的纖維絲，而肌動蛋白又以肌動蛋白單體(或稱球狀肌動蛋白，G-actin)或由單體組裝而成的纖維狀肌動蛋白(F-actin)多聚體2種形式存在。F-actin是由多個G-actin構成的長鏈纖維，2條F-actin反相平行結合成螺旋鏈，發揮生理功能。由微絲形成的微絲束又稱為應力纖維，常橫貫于細胞長軸。微絲對細胞貼附、鋪展、運動、內吞、細胞分裂等許多細胞功能起著重要作用，而微絲又與微管、中間絲組成真核細胞中的三維纖維網絡骨架體系，這些由蛋白質聚合而成的細胞骨架主要功能包括：調節細胞內容物的空間分布，介導細胞內外的信號轉導，調節細胞運動及形態。研究表明，細胞骨架的結構受到多種細胞因子的調節，細胞骨架的改變也與一些疾病的發生密切相關[1]，如囊性纖維化肺這一慢性疾病除了受到相關基因調控外，還提示與誘導增加肌動蛋白的聚合，從而促進微絲束的形成相關[2]。
“動物細胞微絲的觀察”是生物科學本科層次開設的實驗必修項目之一，現有的教學實驗參考指導書[3-5]，大多所列實驗步驟較復雜，實驗所用細胞及試劑材料無法購買，或在本科實驗教學中顯示效果不明顯。近年來，筆者在細胞生物學實驗教學中，利用鼠胚組織進行原代培養并成功傳代培養形成的成纖維狀細胞作為實驗材料，開展了動物細胞骨架的標記及觀察實驗。實驗分別采用非特異性蛋白質染料考馬斯亮藍，以及特異性熒光染料FITC-鬼筆環肽來標記染色，通過光學顯微鏡與熒光顯微鏡來觀察微絲在細胞中的分布及形態特征。與考馬斯亮藍R250這一普通蛋白質染料不同，鬼筆環肽是從毒性菇類中分離的生物堿，它同細胞松弛素的作用相反，不與肌動蛋白單體分子結合，只與多聚體的F-actin結合，而用FITC或Rhodamin等熒光物質標記的鬼筆環肽可特異性的顯示微絲骨架在細胞中的分布。
1 實驗材料
實驗細胞：小鼠鼠胚傳代培養細胞(來源于本科學生培養的鼠胚組織原代培養細胞)。
實驗試劑及器材：1640培養基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、4%多聚甲醛、0.1%TritonX-100、0.25%考馬斯亮藍R250、5μg/mL的FITC-鬼筆環肽、5μg/mL Hochest33258、24孔培養板、24孔培養板用圓形細胞爬片(即圓形蓋片，直徑14mm)、parafilm封口膜。
2 實驗方法
2.1 細胞爬片的制備 將生長良好的鼠胚傳代培養細胞消化后，稀釋細胞至104～105個/mL濃度。準備24孔培養板，每孔預先放入適量血清培養基，并放入無菌圓形爬片，細胞添加至圓形爬片上方。如不用24孔培養板，爬片也可放入無菌培養皿內進行細胞培養。37℃，5%CO2條件下繼續進行細胞培養。
2.2 細胞的固定及通透 24h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，標記生長良好的培養孔，吸去培養基，用37℃預溫PBS輕輕清洗細胞3次，快速洗去殘留的培養基及血清。加入4%的多聚甲醛固定20min，吸去固定液，再用PBS清洗細胞3次。加入0.1%TritonX-100處理20～30min，繼續用PBS清洗細胞3次。小心取出在24孔培養板內培養有鼠胚傳代培養細胞的蓋片，略晾干后，進行后續的染色實驗。
2.3 制片及染色方法 首先，在2片封口膜上分別滴加0.25%考馬斯亮藍R2505μL和5μg/mL的FITC-鬼筆環肽5μL。取出處理過的細胞爬片倒扣在膜上室溫避光染色40min(即細胞面朝下反扣在預加染色液的膜上)，夏季時間可以短一些。染色完成后用PBS輕緩沖洗清洗細胞3次，洗去多余的染液。考馬斯亮藍染色的細胞爬片，可待爬片稍晾干后，直接放于載玻片上用普通光學顯微鏡在白光下觀察。而用FITC-鬼筆環肽染色的細胞爬片，繼續倒扣在5μg/mLHochest33258染液中染色細胞5～10min，用PBS清洗細胞3次后，細胞爬片也同樣放在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察。
2.4 普通光學顯微及熒光顯微鏡的觀察 染色細胞爬片均運用Olympus BX41顯微鏡觀察，40倍物鏡下已能清晰觀察到鋪展良好的成纖維狀鼠胚傳代培養細胞，用DP70攝像頭進行顯微拍攝，并用Image Pro Plus 5.0(IPP)軟件對所有顯微照片進行標尺標記，雙熒光圖片則使用IPP軟件進行熒光照片的拼合。
3 結果與分析
3.1 考馬斯亮藍R250染色效果 運用普通光學顯微鏡在白光下觀察，鼠胚傳代成纖維狀細胞的生長分裂旺盛，細胞鋪展好，形態舒展并有較多的細胞附著在蓋玻片上，可清晰觀察到考馬斯亮藍染色的鼠胚細胞胞體突出豐富，立體感強，不僅可見染成淺藍色縱貫細胞軸的微絲，還可見染成深藍色的細胞核。
3.2 雙熒光染料染色效果 用FITC-鬼筆環肽與Hochest33258雙熒光染色的細胞，用紫外光激發，則細胞核產生明亮的藍色熒光，而用藍光激發，微絲則產生清晰的綠色熒光。用IPP軟件拼合標記細胞核及微絲。
4 結論
在“動物細胞微絲的觀察”教學實驗中，我們運用考馬斯亮藍R250和FITC-鬼筆環肽對微絲進行對照標記顯示。考馬斯亮藍并不能夠特異性地顯示細胞微絲的分布，是利用Triton X-100處理細胞后可以脫除不穩定的非骨架蛋白，而結構穩定的微絲蛋白仍能保留下來染色顯示。而用FITC熒光物質標記的鬼筆環肽可特異性的顯示微絲骨架在細胞中的分布，在本實驗中顯示效果好，熒光清晰，染色對比明顯，有助于學生對細胞微絲理解和掌握。
細胞生物學實驗是一門單獨設課的實驗課程，實驗課只在每周固定時間段開設，學生無法連續進行實驗。近年來，通過多次試驗、反復摸索和研究，形成了從鼠胚原代培養、傳代培養、細胞活性觀察、細胞骨架染色顯示及運用CCK8法檢測細胞增殖這一系列可每周單獨設課的連續實驗內容。其中“動物細胞微絲的觀察”這一實驗項目，根據實驗設計，實驗從已制備好的細胞爬片開始，到最后完成細胞微絲的顯微觀察大約需要4個學時。微絲顯示效果好，學生參與度高，取得了很好的教學效果。
參考文獻
[1]陳業成，趙洪文.細胞骨架與腫瘤之間的關系研究進展[J].國際呼吸雜志，2018(12)：933-936.
[2]Corvol H，Rousselet N，Thompson K E，et al.FAM13A is a modifier gene of cystic fibrosis lung phenotype regulating rhoa activity，actin cytoskeleton dynamics and epithelial-mesenchymal transition[J].Journal of Cystic Fibrosis，2018，17(2)：190-203.
[3]李素文.細胞生物學實驗指導[M].北京：高等教育出版社，2001.
[4]丁明孝，蘇都莫日根，王喜忠，等.細胞生物學實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2013.
[5]桑建利，譚信.細胞生物學實驗指導[M].北京：科學出版社，2010.
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