從國際聯(lián)盟 MiBioGen 的 GWAS 數(shù)據(jù)集中選擇與人類腸道微生物組組成相關(guān)的 SNPs 作為 IV。GWAS 數(shù)據(jù)集中包含了來自美國等 18 340 名參與者的 16S 核糖體 RNA 基因測序圖譜和基因分型數(shù)據(jù)，共有 211 個分類群符合微生物數(shù)量性狀基因座定位分析的條件。為控制種群結(jié)構(gòu)異質(zhì)性對因果效應(yīng)推斷有效性的潛在影響，本研究在孟德爾隨機(jī)化分析中限定遺傳 IV 來源于歐洲群體。在本研究中，屬是最低的分類級別。該研究獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(編號：寧醫(yī)大倫理第 2022-N035 號)。 11.1.2 結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)

　　對于 CVDs 數(shù)據(jù)集，擴(kuò)張型心肌病、冠心病、高血壓病和深靜脈血栓四類疾病分別代表心肌病變、動脈粥樣硬化、血流動力學(xué)異常、凝血功能障礙。從全基因組關(guān)聯(lián)研究 GWAS 數(shù)據(jù)庫中(GWAS ID：finn-b-FG_CVDs)獲得了 CVDs 數(shù)據(jù)，匯總高血壓(GWAS ID：ukb-b-14177)、擴(kuò)張型心肌病(GWAS ID：ebi-a-GCST90018834)、冠心病(GWAS ID：ebi-a-GCST000998)、血栓(GWAS ID：ukb-a-65)數(shù)據(jù)。病例組與對照組的結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)分布情況見表 1。 231.2 IV 選擇

　　為了確保 GM 與 CVDs 之間因果關(guān)系結(jié)論的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，使用以下質(zhì)量控制步驟來選擇最佳 IV：1)選擇與 GM 顯著相關(guān)，顯著性閾值(P<1×10??)SNP 作為 IV;2)需確保所包含的 IV 之間不存在連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)。目前的研究通過結(jié)塊過程(clump_r2 =0.01，clump_kb=5 000)評估 SNPs 之間的 LD;3)確保 SNPs 對暴露的影響與對結(jié)果的影響對應(yīng)于相同的等位基因，刪除回文 SNPs(例如 A/T 或 G/C 等位基因);4)使用 PhenoScanner 數(shù)據(jù)庫中在 R²>0.80 的閾值上刪除與混雜因素和 CVDs 結(jié)局相關(guān)的 SNP。用公式 F=beta²/se² 計(jì)算 F 統(tǒng)計(jì)量;排除 F<10 的 SNP，得到可靠的 SNP 作為 IV。

　　41.3 數(shù)據(jù)分析

　　數(shù)據(jù)分析使用 R 4.2.1 軟件中 TwoSampleMR 包。通過 IV 估計(jì)風(fēng)險因素對復(fù)雜疾病的因果影響。用 5 種方法進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析：以 IVW 為主要方法和研究依據(jù)，以孟德爾隨機(jī)化、加權(quán)中位數(shù)、Simple mode 和加權(quán)眾數(shù)為輔助方法。以 P<5×10??為標(biāo)準(zhǔn)提取 IV。通過留一法檢驗(yàn)結(jié)果的水平多效性。由于人群和 SNPs 的差異，孟德爾隨機(jī)化分析的異質(zhì)性檢驗(yàn)中 F<10 被認(rèn)為無弱 IV 偏倚。 52 結(jié)果

　　以屬為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出 7 個屬，77 個符合條件的 SNPs。真桿菌 4 種：瘤胃真桿菌、短真桿菌、裂鏈真桿菌和產(chǎn)糞固醇真桿菌。瘤胃球菌屬 1 種：扭鏈瘤胃球菌。結(jié)果表明，以擴(kuò)張性心肌病為結(jié)局，真桿菌菌屬中共有 17 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.326，95% CI=1.072～1.639，P=0.009)。以高血壓為結(jié)局，短真桿菌屬中共 8 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=0.992，95% CI=0.984～0.999，P=0.030)。以深靜脈血栓為結(jié)局，瘤胃真桿菌屬共 15 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.003，95% CI=1～1.005，P=0.02)。以冠心病為結(jié)局，在瘤胃真桿菌屬共 8 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.155，95% CI=1.007～1.325，P=0.039)。其中另一種扭鏈瘤胃球菌共 8 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=0.992，95% CI=0.986-0.999，P=0.031)。以 CVDs 為結(jié)局，裂鏈真桿菌屬共有 8 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.058，95% CI=1.002～1.116，P=0.041)。在產(chǎn)糞固醇真桿菌屬中共 14 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.09，95% CI=1.002～1.184，P=0.044)，見表 2。 67

　　以擴(kuò)張型心肌病為結(jié)局，在 R²>0.80 閾值上通過 PhenoScanner 去除與混雜因素相關(guān)的 9 個 SNPs 和與結(jié)局相關(guān)的及回文 SNPs，共提取 157 個 SNP，真桿菌菌屬共 17 個 SNPs 可作為 IV。以高血壓為結(jié)局，共提取 158 個 SNP。短真桿菌屬共 8 個 SNPs 可作為 IV。深靜脈血栓疾病為結(jié)局，刪除 9 個 SNPs 相關(guān)及回文 SNPs，提取 157 個 SNP。扭鏈瘤胃球菌屬共 9 個 SNPs 作為 IV。瘤胃真桿菌屬共 15 個 SNPs 可作為 IV。以冠心病為結(jié)局，共提取 157 個 SNP。瘤胃真桿菌屬共 8 個 SNPs 可作為 IV。另一種扭鏈瘤胃球菌屬中共 8 個 SNPs 可作為 IV。以 CVDs 為結(jié)局，刪除相關(guān)及回文 SNPs 共提取 157 個 SNPs。裂鏈真桿菌屬共 8 個 SNPs 可作為 Ⅳ。產(chǎn)糞固醇真桿菌共有 14 個 SNPs 可作為 Ⅳ，見圖 1。 8

　　GM 和 CVDs 的森林圖可看出，產(chǎn)糞固醇真桿菌與 CVDs 風(fēng)險呈正相關(guān)(P<0.05)，為危險因素;瘤胃真桿菌與冠心病呈正相關(guān)(P<0.05)，為危險因素。埃爾格尼斯氏芽孢桿菌可降低擴(kuò)張型心肌病風(fēng)險(P<0.05)，短真桿菌是高血壓的保護(hù)因素(P<0.05)。瘤胃球菌是深靜脈血栓的保護(hù)因素(P<0.05)，見圖 2。 93 討論

　　本研究結(jié)果表明不同的 GM 對 CVDs 具有不同的影響。GM 可以從 3 種不同的機(jī)制來影響 CVDs 的發(fā)展：GM 可以通過影響各種免疫細(xì)胞來激活免疫系統(tǒng)從而加速 CVDs 的形成 [8];GM 產(chǎn)生的 TAMO 物質(zhì)通過激活血小板活性促進(jìn) CVDs 的形成 [9];在膳食中物質(zhì)通過代謝途徑和免疫反應(yīng)影響動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，因此探究其具體 GM 種類分別對 CVDs 的機(jī)制很有必要 [10-11]。真桿菌屬指一組由革蘭氏陽性、均勻或多形的不形成孢子的、明顯厭氧的和化能有機(jī)營養(yǎng)的細(xì)菌桿狀體組成的細(xì)菌 [12]。有實(shí)驗(yàn)表明在肥胖患者和高脂飲食小鼠模型中均發(fā)現(xiàn)真桿菌屬的減少與動脈粥樣硬化病變的發(fā)展呈負(fù)相關(guān)關(guān)系 [13-14]。在本研究中，真桿菌屬對于 CVDs 是雙刃劍，對擴(kuò)張型心肌病等屬于危險因素;在綜合的 CVDs 數(shù)據(jù)集中又是保護(hù)因素。研究中真桿菌屬的遺傳預(yù)測豐度升高與擴(kuò)張性心肌病和冠心病風(fēng)險呈正相關(guān)，提示真桿菌屬參與兩類 CVDs 的病理進(jìn)程。既往研究也強(qiáng)調(diào)代謝功能的宿主保護(hù)作用 [15]。另有研究表明在 TMAO 通路上，真桿菌屬的部分菌種可將膳食膽堿氧化為 TMAO [16]。另一方面，真桿菌屬參與腸道初級膽汁酸向次級膽汁酸的轉(zhuǎn)化，與擴(kuò)張性心肌病的病理特征吻合。最后，從炎癥與免疫調(diào)節(jié)角度來說，真桿菌屬的脂多糖結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)全身炎癥進(jìn)而加重血管內(nèi)皮損傷和心肌纖維化 [17]。此外，瘤胃球菌屬的遺傳預(yù)測豐度升高與冠心病和深靜脈血栓風(fēng)險呈負(fù)相關(guān) [18]。 11121315

　　綜上所述，GM 和 CVDs 之間具有因果關(guān)系，改善 GM 可能對預(yù)防和治療 CVDs 有一定的臨床意義。然而本研究亦存在局限性，由于在分析中使用匯總統(tǒng)計(jì)量而非原始數(shù)據(jù)，無法進(jìn)行亞組分析以探索是否存在非線性關(guān)系。為了進(jìn)行敏感性分析和水平多效性檢驗(yàn)，有必要將更多的遺傳變異作為工具變量。 164 結(jié)論

　　GM 和 CVDs 之間具有因果關(guān)系，改善 GM 可能對預(yù)防和治療 CVDs 有一定的臨床意義。 18附：表格與圖表說明

　　表 1 病例組與對照組的結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)分布情況

　　結(jié)局n病例組對照組SNPs 數(shù)量

　　CVDs456 468101 866116 926116 926

　　高血壓111 14812 171450 8399 851 867

　　擴(kuò)張型心肌病355 3811 444353 93719 080 278

　　冠心病86 99522 23364 7622 415 020

　　深靜脈血栓337 1596 767330 39210 894 59610

　　表 2 腸道微生物與 CVDs 因果關(guān)系

　　結(jié)局GM (暴露)方法nβSEP 值

　　CVDs裂鏈真桿菌MR-egger80.1410.1390.348

　　Weighted median80.0610.0360.089

　　IVW80.0560.0280.041

　　simple mode80.0720.0560.238

　　Weighted mode80.0720.0510.204

　　產(chǎn)糞固醇真桿菌MR-egger140.5540.1640.006

　　Weighted median140.1580.0590.007

　　IVW140.0850.0420.044

　　simple mode140.1930.1130.113

　　擴(kuò)張型心肌病瘤胃真桿菌MR-egger170.3090.4030.455

　　Weighted median170.2190.1520.149

　　IVW170.2820.1080.009

　　simple mode170.2030.2780.476

　　Weighted mode170.2030.2850.486

　　高血壓病短真桿菌MR-egger8-0.0270.0130.091

　　Weighted median8-0.0080.0040.079

　　IVW8-0.0080.0040.030

　　冠心病瘤胃真桿菌simple mode8-0.0060.0070.431

　　Weighted mode8-0.0060.0060.356

　　MR-egger8-0.0960.2560.721

　　Weighted median80.1840.0900.041

　　IVW80.1440.0700.039

　　扭鏈瘤胃球菌simple mode80.1850.1410.230

　　Weighted mode80.1890.1360.207

　　MR-egger8-0.3050.2430.256

　　Weighted median8-0.2230.1360.101

　　IVW8-0.2140.0990.031

　　simple mode8-0.2130.1990.320

　　Weighted mode8-0.2410.1770.214

　　深靜脈血栓扭鏈瘤胃球菌MR-egger9-0.0060.0090.533

　　Weighted median9-0.0070.0030.034

　　IVW9-0.0080.0030.018

　　simple mode9-0.0060.0050.280

　　Weighted mode9-0.0060.0040.191

　　瘤胃真桿菌MR-egger150.0020.0040.678

　　Weighted median150.0030.0010.037

　　IVW150.0030.0010.029

　　simple mode150.0030.0030.226

　　Weighted mode150.0030.0020.19414

　　圖 1 GM 與 CVDs 因果關(guān)系的散點(diǎn)圖(原文圖 1 對應(yīng)內(nèi)容)

　　通過散點(diǎn)圖展示不同菌屬與各類 CVDs 的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，如埃爾格尼斯氏芽孢桿菌與擴(kuò)張型心肌病、瘤胃真桿菌與冠心病等的相關(guān)性分布。 17圖 2 與心血管類疾病有因果關(guān)系的腸道微生物森林圖(原文圖 2 對應(yīng)內(nèi)容)

　　以森林圖形式呈現(xiàn)各菌屬作為危險因素或保護(hù)因素的 OR 值及置信區(qū)間，例如產(chǎn)糞固醇真桿菌(OR=1.09，95% CI=1.002~1.184)為 CVDs 危險因素，短真桿菌(OR=0.992，

　　1. 研究目的

　　使用孟德爾隨機(jī)化研究方法驗(yàn)證腸道微生物群(GM)與心血管疾病(CVDs)之間的因果關(guān)系1。

　　2. 數(shù)據(jù)來源

　　暴露數(shù)據(jù)：來自 MiBioGen 聯(lián)盟的 GWAS 數(shù)據(jù)集，包含 18340 名參與者的 16S 核糖體 RNA 基因測序圖譜和基因分型數(shù)據(jù)，篩選與 GM 相關(guān)的 SNPs 作為工具變量，限定遺傳 IV 來源于歐洲群體，以 “屬” 為最低分類級別2。

　　結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)：從 GWAS 數(shù)據(jù)庫中獲得 CVDs 數(shù)據(jù)，包括擴(kuò)張型心肌病、高血壓、冠心病、深靜脈血栓，具體病例組與對照組分布見表 13。

　　3. 研究方法

　　IV 選擇：選擇與 GM 顯著相關(guān)(P<1×10??)、無連鎖不平衡、非回文且與混雜因素及結(jié)局無關(guān)的 SNPs，計(jì)算 F 統(tǒng)計(jì)量并排除 F<10 的弱工具變量4。

　　數(shù)據(jù)分析：使用 R 軟件 TwoSampleMR 包，采用 IVW、加權(quán)中位數(shù)、Simple mode、加權(quán)眾數(shù)、MR-Egger 等方法進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析，以 P<5×10??提取 IV，通過留一法檢驗(yàn)水平多效性5。

　　4. 主要結(jié)果

　　擴(kuò)張型心肌病：瘤胃真桿菌(OR=1.326，95% CI=1.072~1.639，P=0.009)可能增加其風(fēng)險6。

　　高血壓：短真桿菌(OR=0.992，95% CI=0.984~0.999，P=0.030)有保護(hù)作用6。

　　深靜脈血栓：扭鏈瘤胃球菌(OR=0.992，95% CI=0.986~0.999，P=0.018)有保護(hù)作用，瘤胃真桿菌(OR=1.003，95% CI=1~1.005，P=0.029)增加其風(fēng)險7。

　　冠心病：瘤胃真桿菌(OR=1.155，95% CI=1.007~1.325，P=0.039)增加其風(fēng)險，扭鏈瘤胃球菌(OR=0.992，95% CI=0.986~0.999，P=0.031)有保護(hù)作用7。

　　總體 CVDs：裂鏈真桿菌(OR=1.058，95% CI=1.002~1.116，P=0.041)和產(chǎn)糞固醇真桿菌(OR=1.09，95% CI=1.002~1.184，P=0.044)可能增加其風(fēng)險7。

　　5. 討論

　　作用機(jī)制：GM 可通過激活免疫系統(tǒng)、產(chǎn)生 TMAO 激活血小板、影響膳食代謝與免疫反應(yīng)等機(jī)制影響 CVDs 發(fā)展8。

　　研究意義：證實(shí) GM 與 CVDs 存在因果關(guān)系，為通過調(diào)節(jié) GM 預(yù)防和治療 CVDs 提供依據(jù)9。

　　局限性：使用匯總統(tǒng)計(jì)量而非原始數(shù)據(jù)，無法進(jìn)行亞組分析及探索非線性關(guān)系，需更多遺傳變異作為工具變量9。

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