摘 要：九香蟲Coridius chinensis是一種藥食兩用的資源昆蟲，溶菌酶是一種能水解細菌中黏多糖的胞壁質酶。本研究克隆了一種九香蟲溶菌酶基因CcLys2，其cDNA長1096 bp，包含一個長672 bp的開放閱讀框，編碼223個氨基酸(aa)。九香蟲溶菌酶蛋白CcLys2的N端包含一段由13 aa組成的信號肽，成熟CcLys2是一種分子量為23.34 kDa的分泌型親水蛋白。成熟CcLys2形成7個α-螺旋和2個β-折疊片的三維分子結構，并由4個二硫鍵穩定其構象。同源性和聚類分析表明，CcLys2與來自斯氏珀蝽Plautia stali的C-型溶菌酶的親緣關系最近。生物信息學分析結顯示，CcLys2很可能屬于具有消化作用的C-型溶菌酶。本研究為今后進一步闡明CcLys2基因的功能及開發新型抗菌藥物奠定基礎。
關鍵詞：九香蟲;溶菌酶;基因克隆;特征分析
多細胞生物常遇到病原生物的侵染，盡管昆蟲缺乏經典意義上的適應性免疫系統，但它們也擁有強大的抗感染手段，如吞噬細菌和包裹寄生蟲的能力，這些反應包括激活胞外蛋白酶級聯、黑化反應及誘導抗菌肽基因表達[1]。溶菌酶(lysozyme)是先天免疫的重要成員之一，作為一種N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，其在生物作用上因種類差異主要有抗菌防御及消化酶的功能[2]。C-型溶菌酶(1，4-β-N-乙酰胞壁酰胺酶)是一種分泌型溶菌酶，多分布于節肢動物、魚類、鳥類及哺乳動物體內，是至今所有溶菌酶中研究得最為廣泛和深入的一類酶. [3]。肽聚糖和殼聚糖是細菌細胞壁的主要成分，而β-1，4-糖苷鍵是穩定肽聚糖和殼聚糖的重要結構，C-型溶菌酶通過特異性裂解β-1，4-糖苷鍵，破壞病原菌細胞壁而具有溶菌活性，保守的天光氨酸和谷氨酸是發揮C型溶菌酶溶菌活性所必需的功能結構位點. [4-5]。
九香蟲Coridius chinensis是一種以葫蘆科植物汁液為食的半翅目兜蝽科昆蟲，主要分布于我國的沿海、中部及西南地區[6]。九香蟲是一種藥食兩用昆蟲，臨床上具有理氣止痛、溫中助陽等藥用功效。該蟲味道及營養價值俱佳，可作為一種保健食品，貴州道真等地都有食用九香蟲的習慣，是臨床上和保健食品中具有極大開發利用價值的資源昆蟲[7-8]。九香蟲具有較強的免疫防護能力，其在野外被外源異物侵染死亡的情況較為罕見，提示九香蟲有著較為完善的免疫系統。研究發現，九香蟲血淋巴中的某些蛋白對細菌和癌細胞都具有抑制或殺傷作用，吳瑪莉[9]等從九香蟲血淋巴中提取的多肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制效果;李尚偉等[10]通過質譜法從九香蟲血淋巴分離得到的CcAMP1對G.+及G.-均具有明顯的抑菌作用;九香蟲血淋巴能顯著抑制胃癌細胞 SGC-7901生長，通過進一步提純發現該蟲血淋巴的蛋白提取物對SGC-7901亦具有顯著的生長抑制活性[11-12]。目前C-型溶菌酶的研究主要集中在脊椎動物及蠅類中，而半翅目昆蟲C-型溶菌酶的研究相對較少。該研究從九香蟲轉錄組數據庫中篩選出一種溶菌酶基因命名為CcLys2，利用反轉錄PCR(reverse transcription-PCR， RT-PCR)克隆驗證了該基因的序列，并用生物信息學軟件和方法對其進行生物信息學分析。該研究為C-型溶菌酶家族再添加一個新成員，為進一步研究CcLys2基因的功能及九香蟲資源的開發利用奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料來源
九香蟲成蟲采集于貴州省貴陽市花溪區，以人工種植的南瓜桿莖飼喂于人工氣候箱內，飼養條件為：溫度(25±2)℃，濕度(68±5%)，光周期14L：10D。
1.2 總RNA提取及第一鏈cDNA制備
根據HP Total RNA Kit(Omega Bio-Tek， GA， USA)說明書提取九香蟲總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，使用NanoDrop 2000紫外分光光度計(Thermo Fisher， MA， USA)檢測其純度和濃度，檢測合格的RNA于-80℃保存備用。第一鏈cDNA的制備根據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher， MA， USA)說明書進行操作，于-20℃冰箱保存備用。
1.3 CcLys2基因克隆
基于從九香蟲轉錄組數據庫中篩選出的一條溶菌酶基因的部分序列，用NCBI的Primer-BLAST設計特異性引物(CL-F： ATGTTGCTGCTCTTCCTCCT; CL-R： CTGACTGACCACACCAAGATTC)，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。在T100 PCR儀(Bio-Rad， CA， USA)上進行目的基因擴增，反應體系為50μL： 25μL2×TsingKe Master Mix(北京擎科生物公司)，2μL cDNA模板，上/下游引物(10 μM)各1μL，補加21μL滅菌超純水。反應條件：94℃預變性3min; 94℃變性30s， 55℃退火30s， 72℃延伸40s， 30個循環;72℃延伸10min。PCR產物經電泳檢測后，回收純化目的基因，連接到pMD18-T載體并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養基上，37℃過夜培養。挑取重組子進行菌落PCR鑒定，送陽性克隆至生工生物工程(上海)有限公司進行測序，將所測序列與轉錄組數據庫中溶菌酶基因序列進行比對驗證。
1.4 生物信息學分析
CcLys2基因的編碼區用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行預測，采用SignalP 5.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽，用ProtParam (https：//web.expasy.org/protparam/) 對酶蛋白進行分子量和等電點預測。用NetOGlyc 4.0Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/) 和NetNGlyc 1.0Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預測糖基化位，DiANNA 1.1web server(http：//clavius.bc.edu/～clotelab/DiANNA/)預測二硫鍵，KinasePhos(http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)預測磷酸化位點，PSORT II Prediction(https：//psort.hgc.jp/form2.html)預測亞細胞定位。用InterPro(http：//www.ebi.ac.uk/interpro)分析酶蛋白的結構域。用DNAMAN 9(Lynnon Biosoft， CA， USA)將CcLys2氨基酸序列與其他13種昆蟲溶菌酶氨基酸序列進行比對，并用MEGA X構建溶菌酶的鄰接樹(NJ法)，重復運行1000次，節點上的數值表示自舉檢驗值。表2為氨基酸序列比對和構建進化樹的溶菌酶來源物種及相應的GenBank登錄號。用PredictProtein(https：//www.predictprotein.org/)預測成熟CcLys2的二級結構，使用 SWISS-MODEL (https：//swissmodel.expasy.org/)的同源建模方法預測其三維結構，用PyMOL2.3(Schrodinger， New York， USA)繪制其分子結構圖。
2 結果與分析
2.1 CcLys2的cDNA克隆
九香蟲總RNA電泳圖顯示清晰的28S和18S兩條帶(圖1-A)，紫外分光光度計檢測顯示其A260/A280比值為1.90，故提取的總RNA濃度及純度較好，能滿足后續的實驗要求。RT-PCR擴增九香蟲溶菌酶CcLys2基因的cDNA序列，得到單一明亮且符合預期大小的條帶，測序驗證其長度為1096bp(圖1-B)。CcLys2基因的cDNA長度為1096bp(GenBank登錄號：MN816376)，包含一個長672bp的開放閱讀框，編碼223個氨基酸(aa)，3′端非編碼區為424bp，具有典型的加尾信號AATAAA(圖2)。
2.1 CcLys2特征分析
九香蟲溶菌酶蛋白CcLys2的N端包含一段由13 aa組成的信號肽，成熟蛋白由210 aa組成。理
A：九香蟲總RNA;B： CcLys2基因擴增。
M： DL2000 DNA marker; 1：CcLys2基因;圖1 九香蟲溶菌酶CcLys2擴增電泳圖Fig.1 Electropherogram of the CcLys2 gene amplification
化性質分析表明，成熟CcLys2的分子式為C1013H1566N282O331S11，分子量為23.34 kDa，理論等電點pI為5.20;含有30個負電荷氨基酸殘基(Asp和Glu)，25個正電荷氨基酸殘基(Arg和Lys)。親水性平均系數為-0.56，不穩定指數為24.32，這表明成熟CcLys2為穩定的親水蛋白。成熟CcLys2具有2個N-糖基化位點(N36， N135)和17個O-糖基化位點，6個磷酸化位點(S82， S132， S134， S151， S198， Y120)。亞細胞定位預測顯示，CcLys2為分泌蛋白，分布在細胞外基質的概率為77.8%，而分布在細胞質及線粒。
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