摘要：[目的]分析鐵皮石斛Dendrobium officinale黃酮類化合物的生物合成途徑及相關(guān)基因，為鐵皮石斛黃酮類化合物代謝調(diào)控、藥用價(jià)值的開發(fā)研究提供參考。[方法]利用IlluminaHiSeq4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)鐵皮石斛2個(gè)生長(zhǎng)階段莖、葉進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)組裝獲得的unigenes進(jìn)行功能注釋和黃酮類化合物的生物合成相關(guān)基因解析。[結(jié)果]鐵皮石斛黃酮類化合物代謝相關(guān)Unigenes48個(gè)，涉及14個(gè)酶。5個(gè)CHS相關(guān)Unigenes具有CHS-like保守結(jié)構(gòu)域，活性位點(diǎn)氨基酸殘基(Cys-His-Asn)高度保守，丙二酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)和產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)的部分氨基酸殘基發(fā)生變異。CHl(Unigene0013781)屬于類型I查爾酮異構(gòu)酶，異構(gòu)化6'-羥基查爾酮為5-羥基黃烷酮。表達(dá)分析表明，2個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的莖和葉，CHS(Unigene0008250)、CHI(Unigene0013781)和F3H的表達(dá)量都高于CHS(Unigene0012884)和C3'H。[結(jié)論]通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，共獲得鐵皮石斛黃酮類化合物代謝相關(guān)Unigenes48個(gè)，涉及14個(gè)酶;5個(gè)CHS相關(guān)Unigenes中，2個(gè)編碼查爾酮合酶，3個(gè)編碼聯(lián)芐合酶;CHl(Unigene0013781)屬于類型I查爾酮異構(gòu)酶。

　　關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;轉(zhuǎn)錄組;黃酮;功能注釋;表達(dá);代謝

　　《分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)》(雙月刊)(Journal of Molecular Cell Biology)創(chuàng)刊于1936年,原名(中國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)雜志)。

　　0引言

　　(研究意義)黃酮類化合物是鐵皮石斛活性成分之一，通過(guò)分析鐵皮石斛高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)掘黃酮類化合物代謝相關(guān)基因，分析代謝途徑，對(duì)鐵皮石斛黃酮類化合物的代謝調(diào)控和藥用價(jià)值的開發(fā)具有重要意義。(前人研究進(jìn)展)黃酮類化合物屬于一類低分子多酚化合物，又稱黃酮體、黃堿素，是一類重要次生代謝產(chǎn)物，核心結(jié)構(gòu)是由15個(gè)碳原子組成的2-苯基色原酮，具有C6-C3-C6基本骨架，由2個(gè)苯環(huán)(A環(huán)和B環(huán))通過(guò)中央3個(gè)碳原子相連。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定的黃酮類化合物有9000多種，可分為查爾酮類、黃酮和黃酮醇類、黃烷酮和黃烷醇類、異黃酮類等。

　　黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、降脂降糖、抗心肌缺血等功能。鐵皮石斛Dendrobium officinale是中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血壓血脂、抗腫瘤等生理活性。黃酮類化合物是鐵皮石斛活性成分之一，不同部位、不同栽培方式和時(shí)間，總黃酮含量存在差異。徐麗紅等比較了不同栽培方式鐵皮石斛黃酮含量(以干基計(jì))，最高的是純野生栽培，為0.25%，最低的是大棚仿野生栽培，為0.09%。唐麗等比較了不同生長(zhǎng)齡鐵皮石斛葉、莖的總黃酮含量，0.5年生長(zhǎng)齡植株莖、葉的總黃酮分別為0.035%和0.104%，高于其他生長(zhǎng)齡。

　　黃秀紅等研究結(jié)果表明：鐵皮石斛盛花期、花苞期和微花期花的總黃酮含量分別為1.66%、1.52%和1.41%，差異顯著。鐵皮石斛花總黃酮對(duì)羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基都具有較強(qiáng)的清除能力，質(zhì)量濃度為10mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH和羥基自由基的清除率分別為89.77%和80.01%，花總黃酮對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子的清除率效果比莖黃酮佳。黃酮類化合物與糖形成苷或以游離苷元形式存在。已經(jīng)從鐵皮石斛中分離到的黃酮苷化合物有新西蘭牡荊苷Ⅱ、蘆丁、新西蘭牡荊苷Ⅰ、佛萊心苷、異佛萊心苷、夏佛塔苷和異夏佛塔苷等，新西蘭牡荊苷Ⅱ是不同道地種源鐵皮石斛共性黃酮苷，能有效抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，濃度50.35uml·L-1，給藥48h，細(xì)胞存活率為50.89%，可能通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路和Bax/Bcl-2，Caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

　　高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以全面分析轉(zhuǎn)錄本，有利于分析次生代謝產(chǎn)物合成途徑，挖掘關(guān)鍵酶基因。馬婧等對(duì)草麻黃高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得類黃酮代謝相關(guān)基因70個(gè)。鄒毅輝等對(duì)半枝蓮進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得注釋unigenes 74185個(gè)，與黃酮類生物合成途徑相關(guān)89個(gè)，其中差異表達(dá)36個(gè)。鄒福賢等對(duì)不同種植時(shí)期的金線蓮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得51370個(gè)unigenes，黃酮類生物合成代謝通路中，22個(gè)基因(6種酶)表達(dá)量差異顯著。(本研究切入點(diǎn))利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，可以發(fā)掘鐵皮石斛黃酮類化合物代謝相關(guān)基因，了解代謝途徑，但目前尚未見到相關(guān)報(bào)道。(擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題)本研究通過(guò)分析鐵皮石斛2個(gè)生長(zhǎng)階段莖、葉的高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)掘黃酮類化合物代謝相關(guān)基因，分析代謝途徑，解析CHS和CHI相關(guān)的unigenes，分析部分關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，旨在為鐵皮石斛黃酮類化合物代謝調(diào)控、藥用價(jià)值的開發(fā)研究提供參考依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1試驗(yàn)材料與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝

　　鐵皮石斛采自福建省龍巖市連城縣冠豸山，經(jīng)過(guò)莖段擴(kuò)繁后，種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所資源圃，于生長(zhǎng)期(2016年8月15日)和成熟期(2016年12月15日)隨機(jī)采集3株新鮮莖、葉樣品供轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別標(biāo)記為T1(生長(zhǎng)期莖)、T2(生長(zhǎng)期葉)、T3(成熟期莖)、T4(成熟期葉)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、數(shù)據(jù)的拼接、組裝和功能注釋由廣州基迪奧生物科技有限公司完成，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq 4000。

　　1.2黃酮類相關(guān)Unigenes分析

　　為了獲得與黃酮類化合物代謝相關(guān)的基因信息，根據(jù)KEGG注釋信息進(jìn)一步獲得Unigenes的Pathway注釋，分析黃酮類化合物代謝通路及相關(guān)unigenes。采用NCBI的BLAST X和BLAST P搜索序列相似性和氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列的多重比對(duì)由軟件DNAMAN V6.0完成。采用MEGA6.0軟件NJ法進(jìn)行分子進(jìn)化樹分析。

　　1.3黃酮類合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

　　利用RPKM(Reads Per kb per Million reads)法計(jì)算Unigene表達(dá)量，分析關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。RPKM法計(jì)算公式為：RPKM=(1000000×C)/(N×L/1000)。其中，設(shè)RPKM為Unigene A的表達(dá)量，C為比對(duì)到Unigene A的reads數(shù)，N為比對(duì)到所有Unigene的總reads數(shù)，L為UnigeneA的堿基數(shù)。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1黃酮類化合物代謝途徑解析

　　4個(gè)樣品的原始數(shù)據(jù)(NCBI SRA號(hào)：SRPl81716)經(jīng)過(guò)拼接、組裝后共獲得43085條Unigenes，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的有8972條。通過(guò)KEGG代謝途徑分析，共獲得48個(gè)黃酮類化合物代謝相關(guān)Unigenes，涉及14個(gè)酶(表1)，根據(jù)Pathway分析的代謝通路結(jié)合鐵皮石斛已經(jīng)報(bào)道的黃酮類成分，推測(cè)黃酮類化合物生物合成途徑見圖1。首先，通過(guò)苯丙烷代謝途徑，在PAL、4CL和C4H的連續(xù)催化下，把苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成黃酮類化合物代謝的起始底物對(duì)香豆酰輔酶A;PAL是苯丙烷代謝的第一個(gè)反應(yīng)酶、限速酶，與PAL相關(guān)的Unigenes 4個(gè)。對(duì)香豆酰輔酶A接下去的反應(yīng)有2條支路：一條是在HCT、C3'H和CCoAOM了等酶的催化下形成咖啡酰輔酶A和阿魏酰輔酶A，再經(jīng)過(guò)CHS的催化形成2'，3，4，4’，6'五羥基查爾酮和4，2'，4'，6'四羥基-3-甲氧基查爾酮;另一條是在CHS的催化下，形成柚皮素查爾酮，CHS是苯丙烷代謝流向黃酮類代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶，相關(guān)的Unigenes 5個(gè)。柚皮素查爾酮經(jīng)CHI異構(gòu)化形成黃烷酮類化合物柚皮素，CHI相關(guān)的Unigenes2個(gè)。柚皮素在F3H、F3'H、F3'5'H、FLS等酶催化下形成二氫黃酮醇和黃酮醇類物質(zhì)。二氫黃酮醇在DFR和LDOX等酶的催化，形成花色素。

　　2.2CHS相關(guān)Unigene生物信息學(xué)分析

　　KEGG代謝途徑分析與CHS相關(guān)的5個(gè)Unigene為Unigene0008250、Unigene0012884、Unigene0023486、Unigene0023487和Unigene0023488。利用DNAMANV6.0軟件預(yù)測(cè)Unigene的開放閱讀框(ORF)和比對(duì)氨基酸同源性，Unigene0008250、Unigene0012884、Unigene0023487和Unigene0023488含有完整的ORF，分別編碼395、390、390和390個(gè)氨基酸，同源性80.18%(圖2);Unigene0023486含部分的ORF，編碼148個(gè)完成氨基酸。采用NCBI的BLAST P搜索氨基酸序列相似性和保守結(jié)構(gòu)域，Unigene0008250、Unigene0012884分別與金釵石斛(Dendrobium nobile)的查爾酮合酶(ABE77392.2)、海棗(Phoenixdactylifera)的查爾酮合酶(XP_008797107.1)同源性最高，為99%和88%。

　　Unigene0023487和Unigene0023488與姬蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)的聯(lián)芐合酶(XP 020572026.1)分別具有87%和93%的同源性;Unigene0023486與蝴蝶蘭(Phalaenopsis Jp.)的聯(lián)芐合酶(P53416)具有96%的同源性。4個(gè)含有完整ORF的Unigenes都具有CHS-like保守結(jié)構(gòu)域，含有3個(gè)活性位點(diǎn)，5個(gè)丙二酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)和6個(gè)產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)。從圖2可以看出，3個(gè)活性位點(diǎn)的氨基酸殘基是保守的，但是，位點(diǎn)ii的N端相鄰兩個(gè)氨基酸殘基發(fā)生變異，Unigene0008250和Unigene0012884是IA，Unigene0023487和Unigene0023488是VP。5個(gè)丙二酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)中，位點(diǎn)1和3的氨基酸殘基保守;位點(diǎn)2和5的氨基酸殘基，Unigene0008250和Unigene0012884為RM和GPA，而Unigene0023487和Unigene0023488為RJ和GRA;位點(diǎn)4的氨基酸殘基Unigene0008250和Unigene0012884為F、Unigene0023487為P、Unigene0023488為A。6個(gè)產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)只有e和f位點(diǎn)保守，b、c、d位點(diǎn)的氨基酸殘基Unigene0008250和Unigene0012884為G、IDG、T，Unigene0023487和Unigene0023488則為A、IGG、L;a位點(diǎn)的氨基酸殘基Unigene0008250和Unigene0012884為EIT，Unigene0023487為ETS、Unigene0023488為ETT。

　　2.3CHI相關(guān)Unigene生物信息學(xué)分析

　　KEGG代謝途徑分析與CHI相關(guān)的2個(gè)Unigenes為Unigene0013780和Unigene0013781。Unigene0013780帶有部分ORF，編碼89個(gè)氨基酸，Unigene0013781帶有完整的ORF，編碼244個(gè)氨基酸，氨基酸同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Unigene0013780編碼的89個(gè)氨基酸與Unigene0013781編碼的一段氨基酸一致性100%。通過(guò)NCBI的BLAST P搜索氨基酸序列相似性和保守結(jié)構(gòu)域，Unigene0013781編碼的氨基酸屬于Chalcone_3superfamily，具有查爾酮.黃烷酮異構(gòu)酶保守結(jié)構(gòu)域，能夠異構(gòu)化查爾酮形成柚皮素(4'，5，7.三羥基黃酮)，與姬蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)的查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶(XP 020583376)同源性為76%。采用MEGA6.0軟件將Unigene0013781編碼的氨基酸序列與來(lái)自其他物種的9個(gè)查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶進(jìn)行NJ聚類分析(圖3)，聚類結(jié)果把10個(gè)查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶分為2類，日本百脈根(Lotusjaponicus)的BAC53983和BAC54038聚為一類，Unigene0013781同其他7個(gè)聚為一類，與姬蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)的查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶(XP 020583376)親緣關(guān)系最近。