篇(1)
摘要：以鷹嘴豆為原料，選取兩株不同來(lái)源的納豆芽孢桿菌F|2|4和S|15，分別通過(guò)單接種和混合接種的方式，制備鷹嘴豆納豆，并測(cè)定其納豆激酶活力，結(jié)果表明：通過(guò)混合接種方式制備的鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力明顯高于單接種方式，當(dāng)F|2|4與S|15接種體積比為1GA6FA1，且接種量為4%時(shí)，鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力達(dá)到最高值6 287.16 UI/g.
關(guān)鍵詞：雙菌發(fā)酵;鷹嘴豆;納豆芽孢桿菌;納豆激酶
0 引言
傳統(tǒng)納豆是以大豆為原料，接種納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilisnatto)后，在一定條件下通過(guò)發(fā)酵而制成的一種豆類食品[1].成熟的納豆呈深黃色，有光澤，口感松軟，表面黏液明顯，用筷子挑起可以拉起很長(zhǎng)的黏液絲狀物質(zhì)，口感微甜，有淡淡氨臭味[2].納豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值很高，具有抗血栓、降血壓、抗腫瘤等多種生理功能，長(zhǎng)期食用可預(yù)防或治療多種亞健康疾病[3].納豆激酶是一種具有強(qiáng)大溶栓活性的絲氨酸蛋白酶[4]，與臨床一線溶栓藥物(尿激酶和鏈激酶) 相比，納豆激酶具有安全性好、成本低、半衰期長(zhǎng)、可口服等優(yōu)點(diǎn)，因此作為溶栓藥物或保健食品備受關(guān)注[5].
盡管納豆是一種成本低、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的健康食品，但因其具有特殊氨臭味，不易被廣大消費(fèi)者接受[6].
鷹嘴豆是僅次于大豆的世界第二大種植豆類[7]，所含氨基酸種類齊全，且包含了人體必需的8種氨基酸[8].
金爽等[9]研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后，具有比傳統(tǒng)納豆氨臭味輕、拉絲現(xiàn)象少、口感好、納豆激酶活性高等優(yōu)點(diǎn).
因此，用鷹嘴豆發(fā)酵制作納豆具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景.
納豆芽孢桿菌是可應(yīng)用于食品的安全益生菌，具有改善人體腸道菌群，助消化，增強(qiáng)肌體免疫力等功能[10].將納豆芽孢桿菌接種到鷹嘴豆上進(jìn)行發(fā)酵，可制成富含納豆激酶的鷹嘴豆納豆.納豆激酶活力是評(píng)價(jià)納豆品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，其評(píng)價(jià)方法很多，主要包括纖維蛋白平板法、纖維蛋白塊溶解時(shí)間法、四肽底物法、酶聯(lián)免疫吸附法、血清板法和Folin-酚法等[11].其中，F(xiàn)olin-酚法簡(jiǎn)單易行、成本低，可以同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，且采用此法測(cè)得的納豆激酶活力與纖溶活力之間存在一定的相關(guān)性[12].
張俊杰等[13]分別從市購(gòu)納豆和土壤中分離出納豆芽孢桿菌，用其發(fā)酵制備鷹嘴豆納豆，并采用Folin-酚法測(cè)定了鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力.高瑞雄等[10]用分離自市購(gòu)納豆中的納豆芽孢桿菌
菌株發(fā)酵得到的納豆中，納豆激酶活力更高;從土壤中分離出的納豆芽孢桿菌菌株，在發(fā)酵鷹嘴豆納豆產(chǎn)納豆激酶方面也有著接近于市購(gòu)納豆中分離出的納豆芽孢桿菌菌株的優(yōu)良性能.此外，接種方式和接種量對(duì)納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)具有重要影響，進(jìn)而影響其發(fā)酵過(guò)程[14].王瑞珍等[15]用納豆芽孢桿菌與戴爾凱氏有孢圓酵母混合接種發(fā)酵核桃粕，納豆激酶活力提高了70.42%.孫軍德等[16]采用沼澤紅假單胞菌和納豆芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵淀粉豆，納豆激酶活力提高了53.74%.
張超鳳等[17]在運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化納豆激酶液態(tài)發(fā)酵條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著納豆芽孢桿菌接種量的增加，納豆激酶活力也在提高，當(dāng)納豆芽孢桿菌接種量為2%時(shí)，納豆激酶活力最高，而當(dāng)納豆芽孢桿菌接種量超過(guò)2%時(shí)，納豆激酶活力急劇下降.
基于此，本研究擬以鷹嘴豆為原料，從分離自市購(gòu)納豆和土壤的納豆芽孢桿菌中各挑選一株高產(chǎn)納豆激酶菌株，同時(shí)設(shè)置不同的接種量梯度，并分別采用單接種和混合接種兩種方式制備鷹嘴豆納豆，以納豆激酶活力為響應(yīng)指標(biāo)，研究最佳接種量和接種體積比，以期制得具有高納豆激酶活力的鷹嘴豆納豆.
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 原料 鷹嘴豆，購(gòu)自云南文山自治州丘北縣;納豆芽孢桿菌菌株F|2|4和S|15，分別分離自市購(gòu)納豆和土壤，現(xiàn)保存于鄭州輕工業(yè)大學(xué)423實(shí)驗(yàn)室菌庫(kù)(WYCCWF).
1.1.2 主要培養(yǎng)基與試劑 LB固體培養(yǎng)基和胰蛋白胨(生化試劑)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn);Folin-酚試劑(分析純)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn);酵母浸粉(生化試劑)，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠產(chǎn);L-酪氨酸(分析純)，合肥博美生物科技責(zé)任有限公司產(chǎn);HCl，NaCl，Na2HPO4，KH2PO4，Na2CO3，MgSO4等化學(xué)試劑(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司產(chǎn).
1.1.3 主要儀器與設(shè)備 DH-600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱、
101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn);SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn);DMEX30型生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司產(chǎn);BCD-221TMBA型冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn);FORMA-86C型超低溫冰箱，鄭州金友寧儀器有限公司產(chǎn);ZWY-100H型搖床，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn);AE224型分析天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn);TGL-16G型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn);SC-15型恒溫水浴鍋和SCIENTZ-10N型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn);T6型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn).
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 菌株的活化
從-80 ℃冰箱中取出篩選保存的供試納豆芽孢桿菌菌株F|2|4和S|15甘油管，
待甘油管在室溫下融化后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)吸取100 μL菌液，采用劃線平板法均勻涂在LB平板上，于37 ℃條件下倒置培養(yǎng).待菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落接種于50 mL液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，備用.
1.2.2 鷹嘴豆納豆的制備 鷹嘴豆納豆的制備工藝流程為：
原料預(yù)處理→蒸煮→接種→發(fā)酵→后熟.具體制作步驟如下.
1)原料預(yù)處理：挑選顆粒飽滿、大小均勻的鷹嘴豆，清水淋洗去除鷹嘴豆中的雜質(zhì)，于室溫下清水浸泡24 h.
2)蒸煮：將浸泡后的鷹嘴豆在0.13 MPa壓力下蒸煮20 min.
3)接種：于無(wú)菌條件下按設(shè)定的接種量和接種體積比接種納豆芽孢桿菌.接種后輕輕晃動(dòng)三角瓶，使鷹嘴豆與菌液充分接觸.
4)發(fā)酵：于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)24 h.
5)后熟：發(fā)酵結(jié)束后，置于4 ℃條件下后熟24 h[13]，即得鷹嘴豆納豆.
1.2.3 單接種實(shí)驗(yàn)
將F|2|4和S|15兩株菌的菌液分別以V(單菌株)GA6FAm(鷹嘴豆)=2%，4%，6%，8%，10%的接種量接種到滅菌蒸熟的鷹嘴豆中，采用1.2.2中的發(fā)酵條件制備鷹嘴豆納豆，然后測(cè)定各樣品納豆激酶活力.
1.2.4 混合接種實(shí)驗(yàn)
將F|2|4和S|15兩株菌的菌液分別以1GA6FA3，1GA6FA2，1GA6FA1，2GA6FA1，3GA6FA1 的體積比混合后，以V(混合菌株)GA6FAm(鷹嘴豆)=2%，4%，6%，8%，10%的接種量分別接種到滅菌蒸熟的鷹嘴豆中，采用1.2.2中的發(fā)酵條件制備鷹嘴豆納豆，同時(shí)測(cè)定各樣品納豆激酶活力.
1.2.5 納豆激酶粗酶液的制備
將發(fā)酵好的新鮮納豆送入預(yù)冷室冷凍至-35～-40 ℃，然后進(jìn)行冷凍干燥，最后用粉碎機(jī)粉碎即得含納豆激酶的納豆樣品粉末.在每g納豆樣品粉末中加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水，于4 ℃條件下浸提4 h，再于4 ℃條件下 4500 r/min 離心20 min，所得上清液即為納豆激酶粗酶液[17].
1.2.6 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
按照表1所示Folin-酚法試劑表依次加入Tyr標(biāo)準(zhǔn)溶液、蒸餾水和試劑A，混勻，室溫放置10 min，再加入試劑B，立即混勻，室溫放置30 min，以0#管作為空白對(duì)照調(diào)0，于 680 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其他各管OD值，然后以酪氨酸(Tyr)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線.
1.2.7 納豆激酶粗酶液OD值的測(cè)定
參考標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999[18]的方法，在1.5 mL離心管中加入300 μL納豆激酶粗酶液，再加入300 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪蛋白溶液，混勻，40 ℃ 水浴加熱10 min，再加入300 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng).于室溫條件下4500 r/min離心10 min.取上清濾液 20 μL，用上述Folin-酚法測(cè)定680 nm波長(zhǎng)處的納豆激酶粗酶液OD值.
1.2.8 納豆激酶活力計(jì)算方法
在40 ℃條件下，每g樣品每min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即被定義為1個(gè)蛋白酶活力單位.樣品納豆激酶活力計(jì)算公式如下.
樣品納豆激酶活力=A10M×45N
式中：A為由樣品測(cè)得的OD值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得相應(yīng)的酪氨酸質(zhì)量/μg;10表示反應(yīng)時(shí)間 10 min;M為樣品質(zhì)量/g;45表示從900 μL反應(yīng)液中取出20 μL進(jìn)行測(cè)定，即45倍;N為酶液稀釋的倍數(shù).
1.3 數(shù)據(jù)處理
使用Origin 9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.
2 結(jié)果與分析
2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與分析
圖1為用Folin-酚法繪制的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.056 5x+0.003，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，表明兩者之間線性關(guān)系良好，能夠用于樣品納豆激酶活力的測(cè)定.
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篇(2)
摘要：隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，人們的日常生活水平也得到了很大提升，這就導(dǎo)致人們對(duì)日常生活中衣食住行各方面的要求都有所提高，尤其是近幾年，人們尤為關(guān)注食品安全健康問(wèn)題，因此，這就對(duì)食品加工提出了更高的要求。大豆制品是人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭豢扇钡模錇槿梭w提供了大量?jī)?yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，因此這就對(duì)于大豆制品的生產(chǎn)過(guò)程以及產(chǎn)品安全質(zhì)量提出了要求。本文筆者將通過(guò)對(duì)大豆制品生產(chǎn)過(guò)程的探索和對(duì)大豆制品生產(chǎn)中傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用的研究，旨在發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)中存在的不足，然后針對(duì)這些不足提供一些可行性的改進(jìn)和革新意見(jiàn)。
關(guān)鍵詞：大豆制品;傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù);改進(jìn)革新
引言：
在眾多的大豆制品中，采取傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)的主要分為四類，即豆醬、豆豉、腐乳及醬油這四大類，而在這四個(gè)品類里面，醬油因?yàn)槭褂玫姆秶訌V闊，且使用時(shí)間更加長(zhǎng)，其自身的質(zhì)量安全管理是十分嚴(yán)苛的，具有比較完整的質(zhì)量管理以及監(jiān)督體系，因此，現(xiàn)階段的醬油一類的產(chǎn)品質(zhì)量安全一直都是達(dá)標(biāo)的，但剩下三種因?yàn)槭褂玫姆秶邢蓿溥€沒(méi)有形成較為強(qiáng)制的產(chǎn)品安全管理體系，其相關(guān)規(guī)范是不完整的，存在一定的安全隱患。
一、大豆制品傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)存在的問(wèn)題
(一)安全性不足
大豆制品傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)在使用過(guò)程中是存在一定的安全隱患的，經(jīng)過(guò)對(duì)大豆制品原料以及發(fā)酵過(guò)程的研究，會(huì)發(fā)現(xiàn)其存在安全性不足的問(wèn)題，這主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是豆制品原料自身的安全性，二則是在發(fā)酵過(guò)程中存在的安全性隱患。
大豆制品的原料主要是黃豆，對(duì)于黃豆而言，其可能會(huì)產(chǎn)生一種名為黃曲霉毒素的化合物，這類化合物是一種毒性很大的代謝產(chǎn)物，對(duì)人體的健康安全危害極為突出，黃曲霉毒素的存在會(huì)直接造成豆制品的產(chǎn)品質(zhì)量安全不過(guò)關(guān)。對(duì)此對(duì)黃曲霉毒素的嚴(yán)格管控是對(duì)豆制品產(chǎn)品安全保障的最基礎(chǔ)部分，但在目前的大豆制品發(fā)酵過(guò)程中，由于對(duì)黃豆原料質(zhì)量的檢測(cè)不到位，以及對(duì)該毒素的檢測(cè)技術(shù)的不完善還是會(huì)產(chǎn)生一定的安全問(wèn)題。
大豆制品中采用發(fā)酵技術(shù)制成的發(fā)酵豆制品，其發(fā)酵過(guò)程是很復(fù)雜的，且其發(fā)酵周期也較長(zhǎng)，這就導(dǎo)致在發(fā)酵的過(guò)程中，很容易滋生出各種各樣的污染，這就對(duì)于后續(xù)豆制品的質(zhì)量安全造成了巨大安全隱患[1]。以豆醬的制作方法為例，豆醬就是將大量黃豆和少量其它作物，如玉米之類的混在一起加水壓坯，然后包裹放置發(fā)酵，發(fā)酵多天后，取出加鹽水進(jìn)行混合，然后定期攪拌直至不再產(chǎn)生氣泡即可。而在這個(gè)發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的微生物，如毛霉、細(xì)菌、曲霉、根霉等，也是因?yàn)檫@些微生物的產(chǎn)生及其之間發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)才使得這些發(fā)酵豆制品的味道產(chǎn)生了翻天覆地的變化，但發(fā)酵中產(chǎn)生的微生物大部分是達(dá)不到食品安全標(biāo)準(zhǔn)的。
(二)化學(xué)性危害
大豆制品中采用傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)可以使其在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生眾多微生物以及微生物的酶，從而加快對(duì)原料大豆的一種溶解，讓人體可以快速吸收其中所蘊(yùn)含的各種營(yíng)養(yǎng)素，因此豆制品深受人們歡迎[2]。但豆制品發(fā)酵中，其氨基酸的含量一定程度上影響著產(chǎn)品質(zhì)量。如發(fā)酵豆制品中所含氨基酸數(shù)量越高，其鮮味越高，而部分企業(yè)生產(chǎn)豆制品時(shí)，為擴(kuò)大利益、提高鮮味，選擇加入一些含氮物質(zhì)來(lái)提高氨基酸的含量，這一行為是不符合食品安全管理規(guī)范的。另一方面，目前大多發(fā)酵豆制品都是采用工廠化生產(chǎn)，其更多關(guān)注于產(chǎn)品生產(chǎn)的數(shù)量和效率，而在生產(chǎn)過(guò)程中，工廠不免會(huì)使用到眾多生產(chǎn)機(jī)械，而在這些機(jī)械中往往會(huì)含有大量重金屬，例如砷和鉛，這些機(jī)械在生產(chǎn)發(fā)酵豆制品的過(guò)程中，大多都是與產(chǎn)品無(wú)距離接觸的，而這些重金屬一經(jīng)污染就很容易對(duì)整個(gè)豆制品的產(chǎn)品安全造成一定影響。
二、大豆制品傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的改進(jìn)和革新措施
(一)建立完善的衛(wèi)生管理體系
經(jīng)過(guò)對(duì)發(fā)酵豆制品的發(fā)酵過(guò)程的各方面研究，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)其中存在的安全隱患很大程度上來(lái)自于其缺乏完善的衛(wèi)生管理體系，對(duì)于大豆制品在發(fā)酵過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量監(jiān)控并不是十分規(guī)范。因此，對(duì)大豆制品傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的改進(jìn)與革新，首先要做到的就是建立完善的衛(wèi)生管理體系，要建立貫穿原料選取到最后產(chǎn)品制成的一體化衛(wèi)生管理體系，從原料選取上，首先就應(yīng)該加強(qiáng)把控，采用現(xiàn)代的各種高科技檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)原料中的各種組成要素，確保原料的安全，接著就是在豆制品發(fā)酵過(guò)程中，應(yīng)對(duì)其中所包含的各個(gè)環(huán)節(jié)都加強(qiáng)管理，實(shí)時(shí)監(jiān)控豆制品的發(fā)酵狀態(tài)，確保其整個(gè)發(fā)酵過(guò)程都是符合食品衛(wèi)生規(guī)范的[3]。另外，對(duì)于制作發(fā)酵豆制品的生產(chǎn)設(shè)備也要嚴(yán)格管控，確保其各項(xiàng)要求都符合食品衛(wèi)生管理標(biāo)準(zhǔn)。最后就是對(duì)完成品的安全檢測(cè)，一定要嚴(yán)格謹(jǐn)慎。
(二)加大對(duì)發(fā)酵技術(shù)的研究
從發(fā)酵豆制品的發(fā)酵過(guò)程來(lái)看，發(fā)酵豆制品存在的安全隱患還來(lái)自于發(fā)酵技術(shù)的不成熟，即在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定的不達(dá)標(biāo)的微生物，這就需要相關(guān)的生產(chǎn)企業(yè)加大對(duì)發(fā)酵技術(shù)的研究[4]。目前，大豆制品采用的發(fā)酵技術(shù)在由原先的自然發(fā)酵向著純種發(fā)酵進(jìn)行轉(zhuǎn)變，其中的關(guān)鍵就是發(fā)酵劑的使用，為此，企業(yè)應(yīng)該加大對(duì)發(fā)酵劑的研發(fā)力度，可以通過(guò)發(fā)酵劑的使用，加快豆制品發(fā)酵的過(guò)程，從而使其在發(fā)酵過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生大量雜菌，并且還可以通過(guò)發(fā)酵劑的使用，使發(fā)酵豆制品中各種有益微生物的利用率也進(jìn)一步提高;且在發(fā)酵劑中適當(dāng)添加一些特殊活性的微生物，可以使大豆制品的化學(xué)構(gòu)成發(fā)生一定程度的轉(zhuǎn)變，可以提高其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì);同時(shí)還可以加入大豆酵母，可以使發(fā)酵豆制品產(chǎn)生豐富的氨基酸，提高發(fā)酵豆制品的鮮味。但在使用發(fā)酵劑的時(shí)候，一定要對(duì)發(fā)酵劑的質(zhì)量安全做到嚴(yán)格管控，確保其符合食品安全規(guī)范，要做到盡量避免傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)中存在的一些弊端[5]。除此之外，對(duì)于發(fā)酵技術(shù)的研究還可以從縮短發(fā)酵周期這一方面考慮，即利用酶制劑保溫發(fā)酵技術(shù)，這一技術(shù)在發(fā)酵過(guò)程中的使用，可以加快對(duì)大豆的溶解，同時(shí)還能進(jìn)一步提高發(fā)酵豆制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其在一定的溫度和時(shí)間內(nèi)可以使整個(gè)豆制品發(fā)酵周期有所減短，這就使得整個(gè)發(fā)酵過(guò)程能更加安全衛(wèi)生。與此同時(shí)，還可以在發(fā)酵豆制品中添加一些酵母菌、乳酸菌，可以調(diào)整豆制品的口味，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。