【摘要】目的：探討針灸治療不完全性截癱對bFGF陽性表達的影響及其對脊髓損傷修復的意義。方法：采用不完全性截癱兔模型，于傷后6 h、7 d、15 d取損傷脊髓組織3 mm長，用免疫組織化學S-P法染色，并用美國產Optimas6.51彩色圖象分析系統進行圖像分析。結果：造模后，bFGF表達主要在脊髓白質部位，并于第7 d開始針灸組脊髓白質灰質陽性顆粒表達明顯下降，出現低谷，而模型組明顯上升，第15 d均稍有恢復。結論：針灸作用于截癱早期脊髓損傷的機理為對內源性bFGF的抑制，7 d時明顯降低BFGF合成釋放，達到抗瘢痕形成，抗粘連作用，從而減輕繼發性損害有關，為脊髓功能恢復提供了有利條件。本文選自：《針灸臨床雜志》是由中華人民共和國新聞出版總署、正式批準公開發行的優秀期刊。自創刊以來，以新觀點、新方法、新材料為主題，堅持"期期精彩、篇篇可讀"的理念。針灸臨床雜志內容詳實、觀點新穎、文章可讀性強、信息量大，眾多的欄目設置，針灸臨床雜志公認譽為具有業內影響力的雜志之一。針灸臨床雜志并獲中國優秀期刊獎，現中國期刊網數據庫全文收錄期刊。

　　【關鍵詞】針灸;脊髓損傷/脊髓損傷修復;bFGF陽性表達

　　截癱尤其是不完全性截癱已成為臨床的常見病和疑難病，其主要原因是傷后繼發損害不斷加重，發展最終導致不可逆改變。針灸對其療效確切，以成為截癱恢復的重要手段之一。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一個多功能因子，能刺激血管生成和神經元的增殖、分化。其神經營養作用包括促進神經細胞再生和存活，保護受損神經細胞抵御興奮性氨基酸的神經毒作用[1]。隨著研究的深入，它對神經系統生長、發育中的作用越來越受到重視。我們對針刺不完全性截癱兔的損傷脊髓部位的bFGF陽性表達作了動態對比觀察，以探討針灸治療截癱的機理。報道如下。

　　1　材料與方法

　　1.1　材料

　　①實驗動物與分組：由湖南中醫學院日本大耳白兔飼養中心，提供健康雄性日本大耳白兔70只，體重2.0～2.5 kg。隨機分為非脊髓損傷組，造模損傷6 h組、7 d組、15 d組，針刺6 h組、7 d組、15 d組，每組10只;②兔不完全性截癱模型的制備：兔不完全性截癱模型采用壓迫法[2]，造成不完全性脊髓損傷，正常對照組與模型組、針灸治療組一樣常規麻醉，顯露第七腰椎間孔切斷黃韌帶，插入麻醉導管膠囊，并用皮膚尾線固定，但不注入典必樂，不予壓迫，24 h后拔掉導管;③模型組不行治療，針灸治療組在模型形成后6 h內即開始針灸治療。

　　1.2　針灸治療方法

　　1.2.1　頭皮針刺激法

　　頭針運動區、感覺區，沿頭皮分三段刺入帽狀腱膜下，施小幅度高頻率捻轉手法，再配以電針(不完全性截癱多表現為遲緩性癱，采用斷續波)增加刺激量。每次25 min，1次/d。

　　1.2.2　針灸督脈方法：

　　在損傷脊髓平面上、下兩椎體棘間隙各進一針至硬膜外，捻轉勿提插，得氣后通以微量電流[波形同(1)]。損傷早期可采用隔姜灸督脈損傷部位。每次25 min，1次/d。

　　1.2.3　配合體針刺

　　取“環跳”“委中”“殷門”“涌泉”“次髎”等穴。針刺行平補平瀉法，留針25 min，1次/d。

　　1.3　標本采集及觀察指標

　　1.3.1　在模型形成6 h、7 d、15 d時，空氣栓塞分批處死大耳白兔。電鏡液固定損傷脊髓部位，取3 mm長，損傷脊髓用10%的中性福爾馬林固定液再固定，常規石蠟包埋切片，經He常規染色后鏡下觀察出血、壞死、炎性滲出情況，每組篩選3～5個陽性反應顯著標本行免疫組化染色分析。

　　1.3.2　主要試劑

　　兔抗兔bFGF單克隆抗體、SP免疫組織化學試劑盒，DAB顯色劑(由武漢博士德生物工程有限公司提供)。

　　1.3.3　bFGF免疫組化染色

　　①石蠟切片常規脫蠟至水;②10%過氧化氫37℃孵育10 min，微波抗原修養;③羊血清孵育10 min，滴加-抗4℃過夜;④滴加二抗37℃孵育30 min;⑤滴加三抗37℃孵育30 min;⑥DAB顯色蘇木素復染;⑦脫水透明封片。

　　1.4　圖象分析和統計處理

　　應用美國產Optimas 6.51彩色圖象分析系統(湖南中醫學院診斷所提供)在10×40倍視野光學顯微鏡下對bFGF免疫組織化學染色陽性反應物進行定量檢測，分別拍攝并測定損傷脊髓灰質，(前、后角，灰質聯合共5個視野)和白質(前后索側索共6個視野)灰、白質共11個視野陽性信號數和灰度(Mean Gray)。用SPSS.11.5統計軟件進行方差分析，P<0.05視為有顯著性差異[3]。

　　2　結果

　　2.1　免疫組織化學染色顯微鏡下結果，見下圖。

　　2.2　針灸組、模型組圖象灰度與陽性信號數變化對比分析

　　見表1-3，動態變化見表4。表1　脊髓灰、白質6 h時相變化表2　脊髓灰、白質7 d時相變化　　表3　脊髓灰、白質15 d時相變化　表4　脊髓灰、白質不同階段的動態變化

　　數據通過方差分析q檢驗得出：模型組白質灰質各時相灰度無顯著差異(P>0.05)。灰質中，造模第7 d時陽性信號數顯著升高(P<0.05)。白質中，于造模第7 d、第15 d出現陽性信號數升高。針刺組白質灰質的灰度在第7 d、第15 d升高。陽性信號數6 h顯著高于7 d時，并于第7 d出現陽性信號低谷，差異顯著(P<0.05)。15 d時又升高，基本同于正常組。針灸第7 d時，灰白質灰度均顯著升高，信號數顯著下降，為控制瘢痕形成，減少粘連創造了有利條件。為治療損傷修復進入關鍵階段。針灸組灰白質比較：6 h、15 d時陽性信號數白質明顯高于灰質。

　　3　討論

　　bFGF，在截癱損傷過程中參與神經元保護與修復及促進突觸再生的作用已被證實[4]。有研究表明，中樞神經系統損傷局部環境存在自我修復因素，多種生長因子表現為短暫性升高[5]。同樣，當脊髓發生損傷時，脊髓組織細胞外基質中的bFGF被大量激活，以誘導毛細血管生長、引起炎性細胞介質的聚集，通過促進細胞的有絲分裂，來促使成纖維細胞的增殖。從而，有bFGF參與形成的瘢痕組織便成為了神經細胞再生的障礙之一。在本研究中，可以見到在不完全性截癱兔模型造模后第7 d bFGF的陽性表達出現顯著升高，在第15 d時稍有回落，神經原細胞水腫明顯，并可見炎性浸潤、血管組織增生，表明bFGF的表達與脊髓的繼發性損傷密切相關。7 d時為神經組織瘢痕形成期，模型組7 d顯著升高，說明bFGF既是促進神經元保護修復的因素，又是形成瘢痕的因素之一。

　　從截癱的治療方法來看，現代應用于臨床的主要是手術及康復治療。截癱手術，如“脊髓斷端縫合術”、“神經根脊髓植入術”、“肋間神經馬尾神經吻合術”等，手術難度大，術后的瘢痕粘連是手術成功率小的主要原因，手術創傷大，術后仍須進行長時間的康復治療，臨床上不能被普遍接受和采用。至于康復治療，西醫主要靠神經組織自身的功能“蘇醒”及功能鍛煉，亦未取得明顯療效。近年來，針灸作為康復手段治療截癱取得了一定進展，療效卓著，具有很好的臨床應用前景。然而，針灸作用機理還遠未被闡明。已有研究表明，針灸作用于神經損傷的途徑之一可能是與減輕或抑制了bFGFmRNA的表達有關[6]。本實驗采用免疫組織化學方法檢測了針灸作用于截癱模型的bFGF動態表達。結果顯示，針灸治療組bFGF陽性表達主要表現在脊髓白質部位，6 h顯著增高為第一高峰，是截癱形成自身保護、自我修復因素的良好信號。損傷第7 d出現bFGF陽性信號數明顯降低，呈現一個低谷，與模型組7天達到最高峰相反。與光鏡下神經原細胞水腫等炎性表現明顯較模型組減輕相一致，提示針灸作用于截癱早期脊髓損傷的機理與對內源性bFGF的抑制有關。針灸通過作用于受損的脊髓組織抑制bFGF在體內的合成，減輕了其促進成纖維細胞增殖的作用，減少炎性細胞聚集，從而抗瘢痕抗粘連有利于神經營養物質順利通過及與神經再生創造良好條件，減輕脊髓繼發性損傷，為截癱的恢復提供了有利條件。針灸作用于脊髓bFGF表達的時相變化，可為針灸治療截癱的臨床研究機理探討提供參考依據。

　　【參考文獻】

　　1　林劍.堿性成纖維細胞生長因子[J].暨南大學學報(自然科學版),1993,14(1)：99.

　　2　劉潔，胡湘明，等.建立兔急性壓迫型不完全性截癱模型的實驗研究[J].湖南中醫學院學報，2003,10(5)：1-4.

　　3　賀石林，等.中醫科研設計與統計學[M].長沙：湖南科學技術出版社，2003.331-332.

　　4　Tao Y，Black IB，Dcicco-Bloom E.Neurogenesis in neonatal rat brain is regulated by peripheral injection of basic fibroblast growth factor(bFGF)[J].J Comp Neuro-1,1996,376：653.

　　5　Frautschy SA，Walicke PA，Baird A.Localization of basic fibroblast growth factor and its mRNA after CNS injury[J]. Brain Res,1991,553：291.

　　6　劉世敏，等.不同針灸療法對頸椎椎間盤退變模型大鼠bFGFmRNA表達的影響[J]上海針灸雜志，2003,22(11)：25-27.

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